淋巴细胞分离技术.ppt

E花环试验Erythrocyte Rosette Test,病原生物学实验室(免疫）任书荣,一、实验目的,掌握淋巴细胞分离技术，熟悉免疫细胞的检查及功能,二、原理,T细胞：CD2/SRBCR/E-受体总花环（Et)形成率：T细胞SRBC-42h或过夜E花环，代表总T细胞的百分率。6080。活性E（Ea)花环T细胞SRBC短时间作用后涂片染色镜检E花环，代表T细胞的一个亚群。2040。,三、试剂及器材,(一)肝素(25u/ml)，淋巴细胞分层液(聚蔗糖泛影葡胺)，Hanks液，1SRBC，灭活小牛血清。(二)1ml吸管，注射器、针头、碘酒等。,四、操作,(一)1SRBC悬液制备取脱纤维绵羊血13ml，加等量Hanks液，混匀后1500rpm离心58分钟，洗3次最后用Hanks液配成1悬液。(二)分离淋巴细胞在血球计数板记数淋巴细胞数，并将其配成1107/ml浓度的淋巴细胞悬液。,(三)花环形成试验 1、取107淋巴细胞/ml悬液0.2ml，1SRBC悬液0.2ml和小牛血清0.1毫升，在小试管中混合，置37孵育5分钟。2、取出后500rpm离心5分钟，放4冰箱20分钟。3、取出后轻轻摇动重新悬浮细胞，加半滴美兰液，用滴管吸细胞悬液一滴放载玻片上，加盖玻片后于高倍镜下计数。,五、结果,高倍镜下计数200个以上的淋巴细胞中TRFC的百分数。凡能结合三个以上SRBC者为TRFC。TRFC（%）=TRFC100 未形成花环淋巴细胞数TRFC,六、注意事项,(一)检测的血标本要新鲜，放置时间不要超过34小时。(二)试验用的SRBC要新鲜，脱纤维血4保存不得超过10天。(三)绵羊红细胞与淋巴细胞的比例以161501为宜。(四)E花环计数前，应轻轻旋浮，不能用滴管用力吹打，否则会使形成的花环脱落。,七、报告要求,绘图记录并分析实验结果及意义。,