微生物细胞的破碎技术.ppt
第3章 微生物细胞的破碎,知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。难点：常用破碎方法的合理选用。,胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物细胞本身：单细胞蛋白（SCP）胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等,1 微生物细胞的破碎技术概述,细胞壁的组成和破碎阻力,细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交联的紧密程度和厚度。丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。,几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围；,最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物。破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。,真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,各种微生物细胞壁的结构与组成,2 微生物细胞的破碎技术,高压匀浆法,高压匀浆器 采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂,第35页最下面,高压匀浆器,高压匀浆法特点,破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片细小，胞内物质释放完全不适合霉菌合格兰氏阳性菌,影响因素,操作压力（5070MPa）细胞浓度（20）温度循环次数(25),珠磨法,珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。,35页第一段,高速珠磨机,珠磨法特点,破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片较小，胞内物质释放完全温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和藻类,与匀浆法相同,影响细胞破碎的因素,搅拌速度（7001450r/min）料液的循环速度（50500L/h）细胞浓度（0.30.5g/mL）珠粒大小和填充量（0.451mm；7090),冻结-撞击法（X-press法）一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25C至-30 C形成冰晶体，利用50MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高,37页 4.其他类型的机械破碎方法,撞击破碎器,超声波法细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。（课本未作比较）该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。,36页 3超声波破碎 第1段,电声超声波发生器,化学法 采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂酸使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。常用表面活性剂有胆酸盐、磷脂、SDS、CTAB、有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等,37页 化学渗透法,化学法优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备等优点，故使用较多。缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难总结：酸碱容易造成产物水解或变性，慎用；表面活性剂以及丁酯、丁醇、丙酮等有机溶剂适合于绝大部分非蛋白类的物质；,课本未作详细比较,酶解法利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。,38页 注意书上举例（外加酶、自溶）,渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。,课本未直接提到，但此法作为化学法的重要补充,冻结-融化法将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。,38页最下面,干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。,书上为讲到,细胞破碎主要方法,39页 表3-2,3 破碎方法的选择,细胞的量有些方法不适合大规模细胞破碎破碎条件目标产物对破碎条件的敏感性破碎目标待破碎细胞的机械强度处理成本、后处理工艺等,4 破碎率的测定,1.直接测定法:细胞计数2.测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率,33页 破碎动力学 关于破碎率的定义及测定方法,6.基因工程表达产物的后处理 包含体的分离与复性,什么是包含体 外源蛋白质基因在受体菌中表达时形成的没有活性的蛋白质聚集体称为包含体。包含体内除目标蛋白外还有微量的质粒，rRNA和RNA聚合酶。包含体蛋白的一级结构是正确的，但空间折叠错误，故没有生物活性。要得到天然活性蛋白，必须在分离回收包含体后，使包含体重新折叠，恢复天然构象。,5.基因工程表达产物的后处理 包含体的分离与复性,包含体形成的原因 蛋白质的多肽链折叠成立体结构的过程中受周围环境的影响，分子间的相互作用影响到分子内的折叠。,5.基因工程表达产物的后处理 包含体的分离与复性,包含体形成的原因 一般认为包含体的形成是由于表达的外源蛋白缺少某些折叠的协助因子或局部微环境不适宜，不能正确的形成次级键。包含体很可能是表达蛋白中间折叠体高浓度积聚在一起形成的不溶物。,5.基因工程表达产物的后处理 包含体的分离与复性,包含分离的工艺路线,机械破碎,离心提取包含体,加变性剂溶解,除变性剂复性,化学破碎，溶解包含体（加变性剂）,离心除细胞碎片,除变性剂复性,5.基因工程表达产物的后处理 包含体的分离与复性,包含分离的工艺路线,机械破碎,洗滤去除可溶杂质,加变性剂溶解,除变性剂复性,除变性剂复性,机械破碎,加低浓度变性剂洗滤,洗滤去除可溶杂质,加变性剂溶解,
