微生物培养基(下).ppt
4.3 培养基的设计与优化,成分&最佳配比 从生化反应的基本原理来推断和计算？经验 配方实验,4.3.1 培养基成分选择的原则4.3.2 培养基的优化（正交实验）4.3.3 培养基设计时注意的一些相关问题,4.3.1.1 菌种的同化能力,选用大分子原料时，应首先考虑微生物是否具有相应的水解酶。否则，只能利用简单物质。分泌型水解酶 例如：酵母菌最多只能利用2-3糖，不能利用淀粉等多糖。所以酿酒等工业必须先将淀粉质原料糖化。糖化：淀粉 葡萄糖,淀粉水解糖：,主要成分：葡萄糖次要成分：二糖、三糖等低聚糖；脂肪、蛋白等杂质。低聚糖存在的危害：降低原料利用率；抑制微生物生长；降低发酵液可发酵营养成分；增加黏度影响淀粉水解糖质量的因素：原料质量；水解工艺与设备。淀粉水解糖制备工艺：酸法；酸酶法、双酶法。,N源：许多微生物缺乏蛋白酶，不能直接利用蛋白质等作氮源，可先将蛋白质人工水解为氨基酸液。常用的蛋白质水解液:,棉籽饼水解液血蛋白水解液 豆饼水解液,在配制培养基时，应根据微生物的特性和培养目的，注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合，发挥各自的优势,避其所短。,4.3.1.2 代谢的阻遏与诱导,葡萄糖效应：速效碳源葡萄糖被菌体利用时产生的分解代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性。种子培养基所含的速效碳氮源往往比作为发酵培养基多。酶制剂生产：对许多诱导酶来说，易被利用的碳源不利于产酶，而难被利用的碳源(如淀粉、糊精等)对产酶是有利的。因而淀粉糊精等多糖也是常用的碳源，特别是在酶制剂生产中几乎都选用淀粉类原料作为碳源。,能分泌蛋白酶的菌株，在有机氮源上可很好生长。同一菌株在不同的生长阶段对氮源的利用能力不同，在生长早期利用容易同化的铵盐和氨基氮，在生长中期则由于代谢酶系已形成则利用蛋白质的能力增强。,有些产物会受氮源的诱导与阻遏，蛋白酶生产尤为明显。通常蛋白酶的生产受蛋白质或多肽的诱导，而受铵盐、硝酸盐、氨基酸的阻遏。这时在培养基氮源选取时，应考虑以有机氮源(蛋白质类)为主。,4.3.1.3 合适的C、N比,C,N,C/N都需要适当C源：碳架，能源N源C/N=100：（）碳氮比也随碳源及氮源的种类以及通气搅拌等条件而异，因此很难确定一个统一比值。,4.3.1.4 pH的要求,微生物在利用营养物质后，由于酸碱物质的积累或代谢酸碱物质的形成会造成培养体系pH的波动。,发酵过程中调节pH的方式一般不主张直接用酸碱来调节：因为培养基pH的异常波动常常是由于某些营养成分的过多(或过少)而造成的，因此用酸碱虽然可以调节pH，但不能解决引起pH异常的原因,其效果常常不甚理想。,4.3.2 培养基的优化,培养基设计过程:、根据前人的经验，初步确定可能的培养基成分;、通过单因子实验最终确定出最适宜的培养基成分;、当培养基成分确定后,剩下的问题就是各成分最适的浓度,由于培养基成分很多,为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。,具体分为四步:,、根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表;、根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验;、根据正交表给出的实验方案，进行实验;、对实验结果进行分析，选出较优的实验条件以及对结果有显著影响因子。,4.3.2.2.1 正交实验设计,举例:确定赖氨酸产生菌FB31发酵培养基成分玉米浆、豆饼水解液、硫酸铵适宜浓度及其对发酵的影响。,解:利用正交设计安排实验并分析结果。(1)、确定因子和水平，列出因子水平表根据经验，豆饼水解液、玉米浆和硫酸铵的浓度变化见表，共3个因子每个因子取三个水平。,K1,k2,k3之间的差异是由于各因子取三个不同的水平导致.,(3)实验结果及分析 正交实验结果的统计分析方法有极差分析法与方差分析法两种。,3、培养基设计在发酵过程优化控制中的作用和地位,分批发酵可分两个阶段:生长阶段:微生物快速生长，产物几乎不合成.菌体酶系的变化主要发生该阶段。产物形成阶段：时间相对较长，菌浓仅有少量变化，产物快速积累。菌体的酶系是相对稳定。,控制菌体的生长，使产物合成酶系形成。这一阶段虽时间较短，但很关键，因为酶系的形成往往是不可逆的。必须从代谢调控机制入手，分析制约产物合成的调控机制，分析营养和环境条件，找出主要控制因素，保证菌体长好后，处于最佳产物合成状态。,生长阶段控制重点：,控制产物的合成。该阶段酶系相对稳定，这就有可能分析底物浓度对反应速度的影响，找出影响最显著的底物，建立动力学方程，进行优化控制，并保证其他底物浓度能维持在一个恰当的水平，使产物的合成过程最经济。,产物形成阶段控制重点：,往往过分强调反应速度的控制，即仅从动力学角度研究优化控制问题，常采用的方法是对众多影响因素进行了简化，归结为某一主要因素，并以此建立起动力学模型，进一步在此基础上运用数学方法进行过程优化。这种研究方法经得起实践考验的不多。其原因也正是对菌体生长阶段和产物形成阶段的控制差异点和重要性考虑不足，对生长阶段的控制本质研究得不透彻。,分批发酵优化控制研究存在的问题与不足：,对于生长阶段的控制，适宜的培养基配制是最重要的手段，也可以说是成功的关键。生长阶段控制必须找出影响产物分泌最适酶系形成的关键因子加以控制。目前已经有一些非常成功的报道，最典型的是谷氨酸发酵中控制生物素的亚适量。,4.3.3 培养基设计时注意的一些相关问题,（一）原料及设备的预处理,发酵原料，有些必须预处理。例1：谷物或山芋干等，要去除杂草、泥块、石头、铁钉等杂物，以避免损坏粉碎机。,例2：国外抗生素用的培养基均要通过200目的筛子。例3：大麦、高梁、橡子等最好先去皮,以防皮壳中有害物质如单宁等带入发酵液；另一方面大量的皮壳占去一定的体积，降低了设备的利用率，易堵塞管道，增加流动阻力。,糖蜜含有大量无机盐、胶体物质和灰分，必须进行预处理。,糖蜜的预处理：,、柠檬酸生产时,由于糖蜜中富含铁离子会导致异拧礞酸的形成，要预先加入黄血盐除铁。、在酒精或酵母生产时,由于糖蜜中干物质浓度大,糖分高、产酸菌多、灰分和胶体物质也很多,酵母无法生长,因此必须经过稀释、酸化、灭菌、澄清和添加营养盐等处理后才能被使用。,（二）原材料的质量,目前对绝大部分产品，培养基中关键调控因子还不很清楚。它常常是一些微量的物质，包含在碳源、氮源等，特别是有机氮源中。因而碳氮源质量的稳定性是获得连续稳定高产的关键。,选择有机氮源时，特别要注意原料的来源、加工方法和有效成分的含量以及储存方法，有机氮源大部分为农副产品，其中所含的成分受产地、加工、储存等的影响较大。因此，原料要定点采购，不要随意更换厂家，一般不要随意更换原料。,例如：黄豆饼粉虽然加工方法都是压榨法,但所用的压榨温度可以是低温(4050)、中温(8090)、高温(100以上)。黄豆饼粉不同的加工方法对抗生素发酵的影响很大,如在红霉素生产时应该用热榨的黄豆饼粉,而在链霉素发酵时应该用冷榨的黄豆饼粉。,（三）发酵特性的影响,培养基中成分含量要考虑发酵规模:红霉素摇瓶发酵-提高淀粉含量可延缓菌丝自溶,提高发酵单位.大规模发酵-”稀配方”-降低成本,灭菌容易,氧传递容易,4.3.3.4 灭菌（略）,
