培养基及一般操作技术.ppt

2023/11/12,1,第三章培养基和一般操作技术,第三章 培养基及一般操作技术,培养基culture medium是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官。,2023/11/12,3,第三章 培养基及一般操作技术,在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。在植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。对植物的营养要求的不断认识，对已有培养基的改进，或者将新发现的植物激素、新的有益成分应用于培养基之中，都大大促进了组织培养研究的迅速发展，取得越来越多的成功。,2023/11/12,4,第三章 培养基及一般操作技术,第一节 培养基的种类和成分 一、培养基种类 二、培养基成分第二节 培养基制备 一、母液配制和保存 二、培养基配制、分装和灭菌第三节 一般操作技术 一、灭菌 三、培养 二、接种 四、驯化移栽,2023/11/12,5,第一节 培养基的种类和成分,不同的植物不同培养部位 不同的培养目的,需选用不同的培养基,一、培养基的种类,培养基多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。,2023/11/12,6,一、培养基的种类,培养基种类,MS培养基1962,B5培养基1968,White培养基1937,N6培养基1975,KM-8P培养基1974,Miller培养基1965,Nitsch培养基1963,WPM培养基1933,2023/11/12,7,一、培养基的种类,1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。无机盐离子 浓度高，硝酸盐含量较高 用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养,MS培养基及特点:,2023/11/12,8,一、培养基的种类,1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。双子叶植物 尤其木本植物组培可选择,B5培养基 及特点：,2023/11/12,9,一、培养基的种类,White培养基特点：1937年由White为培养番茄根尖而设计的，1943年随其专著的出版而问世。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。无机盐数量较低 适于生根培养。,2023/11/12,10,一、培养基的种类,N6培养基特点：1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。成分较简单，KNO3 和(NH4)2SO4含量高 适合花药培养,2023/11/12,11,一、培养基的种类,KM-8P培养基特点：1974年为原生质体培养而设计的。有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质体培养，包括融合的培养。,2023/11/12,12,一、培养基的种类,培养基种类,固体培养基,液体培养基,通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长发育不整齐。,营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。,2023/11/12,13,培养基成分,二、培养基的成分,水,无机盐,有机物,植物激素,培养体的支持材料,其它辅助性物质,2023/11/12,14,二、培养基的成分,（一）水 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,2023/11/12,15,二、培养基的成分,（二）无机元素(inorganic element)无机营养成分就是人们平常所说的矿物质、无机盐或无机元素。它们在植物生活中具有非常重要的作用。如氮（N）、硫（S）、磷（P）是蛋白质、氨基酸、核酸和许多生物催化剂即酶的主要或重要组分。它们与蛋白质、氨基酸、核酸和酶的结构、功能、活性等有直接的不可缺少的关系。,2023/11/12,16,（二）无机元素(inorganic element),氮占蛋白质含量的16%-18%，在植物生命活动中占有首要的地位，故又称为生命元素。磷是能量货币腺苷三磷酸（ATP）的主要成分之一，与全部生命活动紧密相连，在糖代谢、氮代谢、脂肪转变等过程中不可缺少。,2023/11/12,17,（二）无机元素(inorganic element),钾:对于参与活体内各种重要反应的酶起着活化剂的作用，钾供应充分时糖类合成加强，纤维素和木质素含量提高，茎秆坚韧，植株健壮。硫：胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸中都含有硫，这些氨基酸几乎是所有蛋白质的构成分子。镁离子（Mg2+):是叶绿素分子结构的一部分，缺少镁，叶绿素就不能形成，叶子就会失绿，就不能进行光合作用。镁也是染色体的组成成分，在细胞分裂过程中起作用。,2023/11/12,18,（二）无机元素(inorganic element),钙:是细胞壁的组分之一，果胶酸钙是植物细胞胞间层的主要成分，缺钙时细胞分裂受到影响，细胞壁形成受阻，严重时幼芽、幼根会溃烂坏死。现代生物学研究还证明钙是植物体内的信号分子（信使）之一，在植物信号转导中发挥重要作用，钙离子与钙调蛋白结合形成的Ca2+CaM复合体，能活化各种酶，调节植物对外界环境的反应与应答过程。,2023/11/12,19,（二）无机元素(inorganic element),根据植物对这些元素需要量的不同或者根据目前植物培养基中添加的这些元素量的大小，可将它们分成大量元素和微量元素。大量元素一般指在培养基中的浓度大于0.5mmol/L的元素（或100mg/L）。微量元素 指小于0.5mmol/L的元素（或100mg/L）。,2023/11/12,20,培养基的成分 大量元素,1.大量元素 主要包括氮、磷、钾、钙、镁和硫六种。(1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以硝态氮（NO3-N)或氨态氮（NH4-N)两种形式供应。大多数培养基既含有硝态氮（NO3-)又含有氨态氮（NH4+)。氨态氮（NH4-N)对植物生长较为有利。供应的物质有KNO3、NH4NO3等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。缺氮时某些植物的愈伤组织会出现一种很引人注目的花色素苷的颜色，愈伤组织内部不能形成导管。,2023/11/12,21,培养基的成分 大量元素,(2)P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。缺磷或钾时细胞会过度生长，愈伤组织表现出极其蓬松状态。,2023/11/12,22,培养基的成分 大量元素,(3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为1-3mgL为好。制备培养基时，常以KCl、KNO3等盐类形式提供。,2023/11/12,23,培养基的成分 大量元素,(4)Mg、S和Ca Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。常以MgS047H20提供。用量为1-3mgL较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl22H20提供。缺硫时培养的植物组织会明显的退绿；,2023/11/12,24,培养基的成分微量元素,2.微量元素 包括Fe、Mn、Cu、Zn、Cl、B、Mo、Co等。铁是一些酶（氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等）的重要组成成分，又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。但由于Fe的特殊性质，即很不稳定、易沉淀，需要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常常把Fe盐单独配制，且以螯合物的形式存在。,2023/11/12,25,培养基的成分微量元素,B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。Mn 对糖酵解中的某些酶有活化作用，是三羧酸循环中某些酶和硝酸还原酶的活化剂。B 能促进糖的过膜运输，影响植物的有性生殖如花器官的发育和受精作用。B还具有抑制有毒的酚类化合物的形成的作用，改善某些植物组织的培养状况，缺硼时细胞分裂停滞，愈伤表现出老化现象。,2023/11/12,26,培养基的成分微量元素,Zn是吲哚乙酸生物合成必需的，也是谷氨酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等的活化剂。Cu是细胞色素氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的成分，可影响氧化还原过程。Mo是硝酸还原酶和钼铁蛋白的金属成分。,2023/11/12,27,培养基的成分,元素名称 添加形式 N KNO3,NH4NO3大量 P KH2PO4 NaH2PO4元素 K KCl KNO3(0.5mmol/L)Ca CaCl2 2H2O Mg Mg2SO4 7H2O S Mg2SO4 7H2O Fe FeNa2-EDTA微量 B H3BO3元素 Mn MnSO4(0.5mmol/L)Cu CuSO4 Mo Na2MoO4 2H2O Cl CaCl2 2H2O,2023/11/12,28,培养基的成分,有机营养成分,碳水化合物,维生素,氨基酸,肌醇,天然复合物,椰乳、水解酪蛋白、水解乳蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨、西红柿汁、香蕉粉、橘子汁、可可汁,2023/11/12,29,培养基的成分有机营养成分,选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等蔗糖浓度：23%，胚培养为415%高压灭菌部分糖会分解。大生产时可用绵白糖,（三）有机营养成分,1.碳水化合物,2023/11/12,30,培养基的成分有机营养成分,不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。,2023/11/12,31,培养基的成分有机营养成分,种类：VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、VB3(烟酸)、Vc(抗坏血酸)，有时还使用生物素(维生素H)、VB5(泛酸钙)、叶酸、核黄素等。浓度：0.11.0mg/L作用：VB1促愈伤组织产生，提高活力 VB6 促根生长 VB3与代谢和胚发育有关 Vc防组织褐变,2.维生素(vitamin),2023/11/12,32,培养基的成分有机营养成分,3.肌醇（环己六醇）,促进愈伤组织生长以及胚状体和芽的形成对组织细胞繁殖、分化的促进作用浓度100 mg/L,2023/11/12,33,培养基的成分有机营养成分,4.氨基酸(aminoacide)是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。,2023/11/12,34,培养基的成分,为了特殊的培养目的，在一部分培养基中还添加了一些特殊成分，如水解酪蛋白，水解乳蛋白，酵母提取物，胰蛋白胨，椰乳，西红柿汁，香蕉泥，橘子汁，可可汁等天然复合物以及活性炭，渗透调节剂等。,5.天然复合物,2023/11/12,35,培养基的成分天然复合物,1)椰乳(CM)是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10-20 在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。,2023/11/12,36,培养基的成分天然复合物,2)香蕉泥 用量：100-200mg/L。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。,2023/11/12,37,培养基的成分天然复合物,3)马铃薯汁(potato)去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150-200gL。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。,2023/11/12,38,培养基的成分天然复合物,4)水解酪蛋白(CH)或水解乳蛋白(LH)为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸（含有约20种氨基酸的混合物）使用浓度为100-200mgL。受酸和酶的作用易分解。,2023/11/12,39,培养基的成分天然复合物,5)其他 酵母提取液(YE)(0.01-0.05)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(ME)(001-05)苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。,2023/11/12,40,培养基的成分,四、植物激素(hormone),植物激素是指自然状态下植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量（1微摩尔/升以下）有机物；,植物生长调节剂是指一些具有植物激素活性的人工合成的物质。,2023/11/12,41,培养基的成分,植物生长调节物质,植物激素,植物生长调节剂,在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类，少数培养基中还添加赤霉素GA3等,2023/11/12,42,培养基的成分生长素类(auxin),（1）种类IAANAAIBA2,4D（2）作用诱导愈伤组织形成和根分化，促进细胞分裂和伸长生长。根对生长素最敏感，在极低浓度下L)就可促进生长，其次是茎和芽。（3）浓度0.055mg/L，（4）天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。,1、生长素类(auxin),2023/11/12,43,培养基的成分生长素类(auxin),IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA(萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。,2023/11/12,44,培养基的成分生长素类(auxin),IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,2023/11/12,45,培养基的成分生长素类,生长素配制可先用少量95酒精助溶。2，4-D可用01molL的NaOH或KOH助溶。生长素常配成0.2mg/ml的母液贮藏于冰箱中备用。,2023/11/12,46,培养基的成分GA(gibberellic acid赤霉素),(2)GA(赤霉素)种类：有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。培养基中添加的是GA3。作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；特性：赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70-100失效，应当采用过滤灭菌法加入。,2023/11/12,47,培养基的成分细胞分裂素类(cytokinin),(3)细胞分裂素类(cytokinin)这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)、玉米素(ZT)等。其中ZT活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。细胞分裂素使用浓度：0.05-10mgL。,2023/11/12,48,培养基的成分细胞分裂素类,在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细胞分裂和器官分化。细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化,茎、苗的增殖，抑制根的分化。避免在生根培养时使用。,2023/11/12,49,培养基的成分,1、琼脂(agar)作用：最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。特性：溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。浓度：琼脂的用量在6-10gL之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。,五、培养材料的支持物,2023/11/12,50,培养基的成分培养材料的支持物,(2)其他 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等总的要求是排出的物质对培养材料没有影响或影响较小。,2023/11/12,51,培养基的成分,六、其它辅助性物质,1.抗生素2.抗氧化物3.活性炭,2023/11/12,52,培养基的成分其它辅助性物质,1抗生素(antibiotic)种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等用量：5-20mgL。作用：防止菌类污染，减少培养中材料的损失。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5-10的抗菌素。注意：抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，使用要慎重。,2023/11/12,53,培养基的成分其它添加剂,2、抗氧化物(antioxide)酚污染植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，由多酚氧化酶氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色。这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。在木本，尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。,2023/11/12,54,培养基的成分其它添加剂,目前还没有彻底完善的办法，只能按不同的实际情况，加用一些药物，并适当降低培养温度、及时转移到新鲜培养基上等办法，使之有不同程度的缓解，当然像严格选择外植体部位、加大接种数量等也应一并考虑。,2023/11/12,55,培养基的成分其它添加剂,抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及Vc用量：50-200mgL的浓度方法：洗涤刚切割的外植体 表面 或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其他抗氧化剂：苏糖二硫醇、谷胱甘肽、间苯二酚及硫代硫酸钠等。,2023/11/12,56,培养基的成分其它添加剂,3、活性炭(active carbon)活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，有很强的吸附作用，可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。,2023/11/12,57,培养基的成分其它添加剂,使用浓度通常为0.021.0%作用吸附外植体产生的致死性褐化物（初代培养)。促进生根（通过减弱光照保护了IAA），由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进了茎、叶的生长。活性炭可降低玻璃苗的产生频率，使用浓度一般0.3。,2023/11/12,58,培养基的成分其它添加剂,活性炭具有副作用，研究表明：每毫克的活性炭能吸附100ng左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此，在使用时一定要注意用量,使活性炭发挥其积极作用。,2023/11/12,59,第二节 培养基的制备,一、合适培养基的选择合适培养基的选择：基本培养基；各种激素的浓度与配比 MS培养基适合于大多数双子叶植物；B5和N6培养基适合于许多单子叶植物；White培养基适合于根的培养。首先试用这些培养基进行初步实验，在基本培养基确定之后，进行不同种类激素浓度和激素间相互比例的配合试验。,2023/11/12,60,筛选激素配方方法,单因子法：,2023/11/12,61,筛选激素配方方法,双因子法：,2023/11/12,62,0.2mg/ml激素母液用量计算公式,培养基体积(ml)实际应用激素浓度(mg/L)激素母液用量=200mg/ml,2023/11/12,63,培养基的制备母液的配制和保存,二、母液的配制 在植物组织培养工作中，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。,2023/11/12,64,培养基的制备母液的配制和保存,(一)母液配制流程图,称 量,母液分装,确定培养基,溶 解,定 容,贴标签,保存于冰箱,2023/11/12,65,培养基的制备母液的配制和保存,(二)母液配制要求(以MS为例)：,一般母液配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。,2023/11/12,66,培养基的制备母液的配制和保存,具体要求：(1)大量元素母液 可配成浓度10倍母液。(2)微量元素母液 可配成浓度100倍的母液。(3)铁盐母液 可配成100倍的母液，(4)有机物母液 可配成100倍的母液。(5)激素母液的配制 每种激素必须单独配成母液，浓度一般配成0.2mgml。用时根据需要取用。因为激素用量较少，一次可配成50ml或100ml。,2023/11/12,67,培养基的制备母液的配制和保存,激素溶解方法：IAA、IBA、GA 溶于少量的95的酒精，加水定容；NAA 热水或少量95的酒精溶解，加水定容；2，4-D 可用少量1mol NaOH溶解，加水定容；KT和6-BA 溶于少量1mol的HCI中，加水定容；玉米素 溶于少量95的酒精，加水定容。配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期。,2023/11/12,68,MS培养基母液的配制,2023/11/12,69,配制母液时的注意事项,a.各化合物必须充分溶解后才能混合。b.混合时注意先后顺序，特别要将钙离子与硫酸根离子，磷酸根离子错开，以免产生硫酸钙、磷酸钙等不溶性化合物沉淀。c.混合时要慢，边搅拌边混合。,2023/11/12,70,三、培养基的制备,2023/11/12,71,培养基的制备,母液移取：一次性移取，不能吸进吸气球里，数量看准，不滴不漏，吹净为度。,大量元素母液,微量元素母液,铁 盐母液,有机物母液,取100ml,取10ml,取10ml,取10ml,2023/11/12,72,培养基的制备,用蒸馏水定容到1升取蔗糖2530g，琼脂78g。,称取蔗糖、琼脂,2023/11/12,73,培养基的制备,培养基熬制：,1.将定容好的培养液取1/3倒入铝锅中，同时加入称好的蔗糖和琼脂，边煮边搅拌，防止糊底。,2.用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。,3.将容量瓶中剩余的液体一并倒入铝锅中，摇晃使均匀。,2023/11/12,74,培养基的制备,调PH值：,用0.1MNaOH和HCl调PH值为5.8。趁热分装，100ml的三角瓶约装入3040ml,35瓶/L。,2023/11/12,75,培养基的制备,扎口与灭菌:,要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。,培养基应及时灭菌，防止变质。,2023/11/12,76,第三节 一般操作技术,一、灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。菌包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。,2023/11/12,77,一般操作技术灭菌,无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)，高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多。灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的微生物全部杀死。,2023/11/12,78,一般操作技术灭菌,消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用.显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不应带有任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。,2023/11/12,79,一般操作技术灭菌,常用的灭菌方法 物理方法 如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法 使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精等化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料和不同目的适当选用。,2023/11/12,80,一般操作技术灭菌,1、培养基用湿热灭菌高压蒸汽灭菌2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌（95%的酒精，酒精灯火焰上灼烧）3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌（烘箱加热到160-180持续90分钟）4、不耐热的物质采用过滤灭菌（一些生长调节剂如吲哚乙酸、赤霉素、玉米素、脱落酸和一些化学成分在高温高压下会发生降解而失去效能或降低效能）5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌（紫外线灭菌与熏蒸灭菌）6、一些物体表面用药剂喷雾灭菌（75%的酒精，1%-2%的来苏儿溶液以及0.25%-1%的新洁尔灭）7、植物材料表面用消毒剂灭菌,2023/11/12,81,一般操作技术灭菌,1、培养基用湿热灭菌高压蒸汽灭菌,2023/11/12,82,一般操作技术灭菌,培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间,250-500,2023/11/12,83,一般操作技术灭菌,2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌,用前干热灭菌：用前湿热灭菌：121,20-30min接种前用酒精棉球擦试，浸入75%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。,2023/11/12,84,一般操作技术灭菌,3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌,干热灭菌：烘箱加热到湿热灭菌：121,20-40min接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。,2023/11/12,85,一般操作技术灭菌,4、不耐热的物质采用过滤灭菌（一些生长调节剂如吲哚乙酸、赤霉素、玉米素、脱落酸和一些化学成分在高温高压下会发生降解而失去效能或降低效能）,1.过滤器先灭菌，灭菌温度不超过121。2.溶液先进行初滤(滤膜0.65um),滤膜0.45um以下,2023/11/12,86,一般操作技术灭菌,5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌,紫外灯照射(接种室、超净台、接种箱)：波长260nm，距离小于1.2m，20-30min。臭氧灭菌机：1-2h熏蒸灭菌：5-8ml/m3甲醛+5g/m3 高锰酸钾；冰醋酸；1-3%高锰酸钾或3%来苏儿。接种台喷雾消毒：75%酒精。,2023/11/12,87,一般操作技术灭菌,6.实验服、口罩、滤纸灭菌,湿热灭菌：121,20-30min紫外线灭菌。实验服灭菌后置于缓冲间或密封好。,2023/11/12,88,一般操作技术灭菌,7.物体表面用药剂喷雾灭菌,灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌 范围：桌面、墙面、双手、材料表面消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；0.25-1%新洁尔灭；洗衣粉；吐温-80,2023/11/12,89,一般操作技术灭菌,8、培养室灭菌,新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次。隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。,2023/11/12,90,一般操作技术灭菌,9、植物材料表面消毒剂灭菌第一步：清理材料流水冲洗加入吐温（或洗衣粉）清洗 自来水冲洗第二步：对材料的表面浸润灭菌(超净台或接种箱内完成)70%酒精浸10-30秒无菌水 0.1-1%升汞5-8 min 无菌水取用内部材料第三步：灭菌剂处理无菌水漂洗3-4次（或3分钟左右）沥干接种 注：灭菌液要浸没材料,2023/11/12,91,常用灭菌剂使用浓度及效果比较表,2023/11/12,92,一般操作技术接种,二、接种（无菌操作）接种将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。外植体（explant)接种的植物材料。接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。,2023/11/12,93,无菌操作可按以下步骤进行：,（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。,2023/11/12,94,一般操作技术接种,酒精擦拭手,外植体消毒,浸泡5min,2023/11/12,95,一般操作技术接种,酒精灯灼烧,酒精擦拭培养皿,器械消毒,2023/11/12,96,一般操作技术接种,修剪外植体,旋转灼烧,酒精擦拭,2023/11/12,97,一般操作技术接种,培养,塞回瓶塞,接种,取外植体,2023/11/12,98,一般操作技术接种,无菌接种步骤：（1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。（2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。（如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。,2023/11/12,99,一般操作技术接种,（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1-3块为宜。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种，包上包口纸，包口纸里面也要过火。,2023/11/12,100,一般操作技术培养,三、培养 把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。,2023/11/12,101,一般操作技术培养,1培养方法(1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。优点：设备简单，易行.缺点：养分分布不均，生长速度不均衡，常有褐化中毒现象。(2)液体培养法 用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。优点：培养基均一，又能保证氧气的供给（通过搅动或振动培养液的方法）。缺点：需要采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为50-100rmin。,2023/11/12,102,一般操作技术培养,2培养步骤(1)初代培养 即接种某种外植体后，最初的一代培养。旨在获得无菌材料和无性繁殖系。初代培养时，常用诱导（诱导愈伤组织的培养基叫诱导培养基）或分化培养基.初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。,2023/11/12,103,一般操作技术初代培养,根据初代培养时发育的方向可分为：1)顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽-苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整的小植株。,2023/11/12,104,一般操作技术初代培养,一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。适宜这种再生繁殖的植物，在采样时只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取幼苗也可以。茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。,2023/11/12,105,一般操作技术初代培养,2)不定芽的发育方式一：外植体培养经脱分化形成愈伤组织再分化，多数情况下先分化形成芽，后形成根。方式二：从器官中直接产生不定芽。有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力，如矮牵牛、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。,2023/11/12,106,一般操作技术初代培养,在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。,2023/11/12,107,一般操作技术初代培养,3)体细胞胚状体的发生与发育发育方式：通过球形胚心形胚鱼雷形胚子叶形胚胎最终发育成小苗。类似于合子胚但又有所不同，它是由体细胞发生的。从愈伤组织表面产生胚状体的产生：从外植体表面已分化的细胞中产生 从悬浮培养的细胞中产生,2023/11/12,108,一般操作技术初代培养,外植体褐变是指在接种培养一段时间后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。,2023/11/12,109,褐变的原因,在完整植物体的细胞中，酚类化合物与多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。当切割外植体后，切口附近细胞的分隔效应被打破，酚类化合物和多酚氧化酶便流出混合，多酚氧化酶氧化酚类化合物而成为褐色的醌类物质和水。醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体的蛋白质聚合，生长停顿，最终导致死亡。,2023/11/12,110,一般操作技术初代培养,影响褐变的因素：植物品种 研究表明，由于多酚氧化酶活性上的差异，不同品种间的褐变现象是不同的。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。生理状态 由于外植体的生理状态不同，在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。,2023/11/12,111,一般操作技术初代培养,培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。,2023/11/12,112,一般操作技术初代培养,防止、减轻褐变现象发生的措施：选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。合适的培养条件 适宜的较低温度和暗培养、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。,2023/11/12,113,一般操作技术初代培养,使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另