高分子量小麦谷蛋白亚基.ppt
2023/11/6,1,实验一 小麦高分子量谷蛋白亚基测定,2023/11/6,2,实验内容：测定小麦高分子量谷蛋白亚基 实验目的:掌握利用不连续十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离小麦高分子量谷 蛋白亚基（HMW-GS）方法；了解小麦高分子量谷蛋白亚基的命名方法；识别部分常见小麦高分子量谷蛋白亚基图谱。,小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）与小麦的加工品质密切相关，其组成是小麦品质预测的一项重要指标。HMW-GS作为一种分子标记，有助于提高小麦品质性状遗传改良的效率。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术是目前分离小麦 HMW-GS 的主要方法，此方法具有准确、微量、快速、操作简便、分辨率高等优点，尤其是可以分析半粒无胚籽粒的 HMW-GS 组成，所剩余的带胚半粒仍可以播种或组织培养，因此此方法已经成为小麦品种鉴定、亲本选配及其后代筛选的重要方法。,2023/11/6,4,实验原理：小麦高分子量谷蛋白亚基不连续 SDS-PAGE 系统集电荷效应、分子筛效应和浓缩效应为一体，在这三种效应的共同作用下，把小麦谷蛋白亚基按分子量大小分离开来。以亚基组成已知的中国春小麦品种做对照，就可以对待测小麦品种的 HMW-GS 组成进行鉴定。,电荷效应各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定的速度泳动。迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量的大小以及分子的形状等因素。,2023/11/6,6,分子筛效应 由于凝胶具有黏度和较高摩擦阻力，以及其网络结构直接参与了移动颗粒的分离过程，这种区别不同大小分子种类的能力就是凝胶所具有的一种筛分能力即分子筛效应。,浓缩效应 蛋白质样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。,实验材料、药品和器材实验材料：小麦籽粒，小麦普通中国春和马奎斯为对照实验器材：离心机、电泳仪、电泳槽、梳子、制胶架、成像 仪、研钵、振荡器、微波炉、天平、pH计、移 液器、微量进样器、染色盘、摇床、量筒等。实验药品：丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、N,N,N,N,-四 甲基乙二胺、过硫酸铵、二硫苏糖醇、甘氨酸、甘油、十二烷基硫酸 钠、考马斯亮蓝等。,试剂配制：麦谷蛋白提取液：4g SDS+1g DTT+250 ml 0.5M Tris-HCl(PH=6.8)+20 ml甘油+30 mg溴酚蓝+蒸馏水定溶至 100 ml。10电极缓冲液：Tris-HCI 30.3 g+甘氨酸 144 g+SDS 10 g+蒸馏水定溶至 1000ml。30%丙烯酰胺：30 g+蒸馏水定溶至 100ml。2%甲叉双丙烯酰胺：2 g+蒸馏水定溶至 100ml。,1 M Tris-HCI（PH=6.8）:12.1g Tris+蒸馏水定 溶至 100ml,用1 N HCI 调 PH=6.8。3 M Tris-HCI（PH=8.8）:36.3g Tris+蒸 馏水定溶至 100ml,用1 M HCI 调 PH=8.8。10%SDS：SDS 10g+蒸馏水定溶至100ml。10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+蒸馏水定溶10ml。染色液：100mg G-250+12 g三氯乙酸+蒸馏水定溶至200ml。,实验操作步骤1、小麦谷蛋白提取程序取单粒小麦种子研磨成粉，转入离心管中，加入适量的蛋白质提取液，在旋涡振荡器上混合均匀；将离心管放入65水浴锅中水浴45min后取出离心管放，室温冷却；将冷却后的离心管12000转/min离心30min，保存于 4 冰箱备用。,2 电泳程序封板：利用1%琼脂封板，以防玻璃板漏胶；凝胶配制：见表 1。制胶：按表1的配方分别配制 8%和 15%两种分离胶，然后用两个取液器进行以下操作，先吸取1.0ml已经混匀的 15%分离胶，加到玻璃板之间，再向 15%分离胶中加入 8%的分离胶0.5ml，充分混匀后，从中吸取 1.0ml加到玻璃板之间，如此反复操作上述步骤，,2023/11/6,12,直至距玻璃板上缘约 3cm 处时，向胶面上加一层正丁醇，静置，直至分离胶凝固。倒置胶板，流出正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面，用滤纸吸尽多余水。按表1配制5%浓缩胶，混匀后倒入玻璃板之间，将梳子放置在玻璃板间，注意不要产生气泡，静置至胶凝。待浓缩胶凝固后，垂直取出梳子，加蒸馏水，甩出样品槽中的残胶。,2023/11/6,13,表1 分离胶与浓缩胶配方,表1 分离胶与浓缩胶配方,2023/11/6,14,点样：将胶板放在电泳槽中加入电极缓冲液至高出内侧 玻璃板上边约0.5cm，用微量进样器吸取蛋白质10-20ul分别加在每个样品槽底部凝胶面上。电泳：下槽为正极，上槽为负极，每胶板30mA稳流电泳，直至溴酚蓝接近分离胶底部，电泳完毕。,2023/11/6,15,卸胶、染色和脱色：卸下胶板，用手术剪撬开玻璃板，将整块分离胶浸没在0.25%考马斯亮蓝溶液中，放在摇床上缓缓摇动染色过夜；次日，取出凝胶，蒸馏水漂洗直至呈现清晰可见的蛋白质色带。拍照：利用凝胶成像仪或者普通像机拍照观察。,图1小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率，,结果分析 1 小麦高分子量谷蛋白亚基的命名 小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率，按Payne的数字命名法命名，见图1,图1小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率，,2 小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱见图 2,图 2 部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱,2 小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱见图 2,2 小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱见图 2,图 2 部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱,2 小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱见图 2,图3 中国春、红火麦、马奎斯和济麦20 高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱,HMW-GS的变异由Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1三个位点上的等位基因所控制，不同小麦基因型的高分子量谷蛋白亚基组成不同，但也有相同。如中国春、红火麦、马奎斯和济麦20的高分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE图谱见 图 3,图3 中国春、红火麦、马奎斯和济麦20 高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱,注意事项：丙烯酰胺和双丙烯酰胺有很强的神经毒性，容易吸附在皮肤上，且作用有积累性，称量时戴手套和口罩；封板和灌胶时都不能产生气泡，以防漏胶及谱带弯曲；使用过的滴管、玻璃器皿要立即冲洗，以防止凝固堵塞；平板玻璃昂贵，实验过程中要特别小心。实验结束后认真清洗放回原处。,2023/11/6,20,思考题1 简述小麦高分子量谷蛋白亚基不连续 SDS-PAGE原理及其注意事项。2 封板和灌胶时为什么不能产生气泡？本实验是否需在低温下进行？电泳后上下槽的电极缓冲液能否混合存放？3 根据实验过程总结如何做好SDS-PAGE？关键步骤有那些？4 绘制中国春等5个样品的电泳图谱带型。,
