蛋白质化学6-理化性质与分离分析.ppt

蛋白质的理化性质、测定及分离纯化,蛋白质的理化性质,蛋白质的理化性质及应用,蛋白质分子量大，是一种胶体溶液；具有特定的空间构象，分子量一定分子筛层析；在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等；一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域有机溶剂沉淀，疏水层析(反相层析)。,蛋白质的胶体性质,蛋白质分子量大，介于一万到百万之间，故其分子的大小已达到胶粒1-100 nm范围之内。球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈吸引水分子的作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围-水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。与低分子物质相比，蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，在分离提纯蛋白质过程中，可以利用蛋白质的这一性质，将混有小分子杂质的蛋白质溶液置于半透膜制成的透析袋或管内，浮于流动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质皆易从袋中透出，保留了比较纯的蛋白质-透析(dialysis)。,颗粒大小：在1-100 nm之间，属胶体，因此溶于水，成为亲水胶体。稳定亲水胶体的因素：水化膜 表面电荷相同 不通透性：半透膜(semipermeable membrane),蛋白质溶液是一种分散系统，蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。分散相质点小于1 nm为真溶液，大于100 nm为悬浊液，介于1-100 nm为胶体溶液。,透析即用半透膜（透析袋）将大分子蛋白质分离出来。在生物大分子制备过程中除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品，透析法最简便。透析时，小于MWCO（截留分子量）的分子在透析膜二边溶液浓度差产生的扩散压作用下渗过透析膜，其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。欲快速透析可采用直径较小的透析袋以增加膜面积。常用温度：4，升温、更换袋外透析液或用磁力搅拌器，均能提高透析速度。,MWCO:molecular weight cut-off,疏水区域,蛋白质分子上的电荷与疏水区,蛋白质大分子溶液在一定溶剂中超速离心时可发生沉降。沉降速度与向心加速度之比值即为蛋白质的沉降系数S。s=v/2r s是沉降系数(sedimentation coefficient)，是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，蛋白质、核酸、核糖体、病毒等的沉降系数通常为1-200 10-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S（斯维德贝格单位，Svedberg unit），即1S=10-13秒，如血红蛋白的S约为410-13秒或4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。,1924年Svedberg（离心法创始人-瑞典蛋白质化学家）对沉降系数的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。,蛋白质的两性电离和等电点,蛋白质由氨基酸组成，分子中除两端的游离氨基和羧基外，侧链上还有一些解离基团，如Glu、Asp残基中的和-羧基，Lys残基中的-氨基，Arg残基的胍基和His的咪唑基。作为带电颗粒，可以在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带的电荷性质。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷，既取决于其分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液pH影响。当处于某一pH时，蛋白质兼性离子(zwitterion)的净电荷为0，此时溶液的pH值为蛋白质的等电点(isoelectric point，pI)。处于等电点的蛋白质颗粒，在电场中并不移动。蛋白质溶液的pH大于等电点，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。,溶液中的蛋白质颗粒,pH=pI时，蛋白质分子所带净电荷为零，蛋白质分子在电场中不移动。pHpI时，蛋白质分子所带净电荷为负，蛋白质分子在电场中向阳极移动。pHpI时，蛋白质分子所带净电荷为正，蛋白质分子在电场中向阴极移动。在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用，所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。,蛋白质在等电点时的溶解度最小,pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用,蛋白质的变性(Denaturation),天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，如酶失去催化活力、激素丧失活性，即蛋白质的变性作用(denaturation)。变性只是蛋白质空间构象的破坏，一般认为蛋白质变性的本质是次级键、二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。,引起蛋白质变性的因素,引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两大类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。,在变性因素的作用下，可导致各种变性现象。首先是生理活性丧失，如酶变性后，失去催化功能；激素变性后，失去生理调节功能；微生物体内的蛋白质变性后，微生物失去生命力而死亡。这是变性作用最主要的特征。此外，变性后的蛋白质还表现出各种物理和化学性质的改变。天然蛋白质变性后，多肽链松弛伸展，导致粘度增大，内部的侧链疏水基团暴露于表面，导致溶解度下降而易沉淀。同时由于变性后，结构松散，侧链基团暴露，还使得其易于发生化学反应，例变性蛋白质容易被酶水解。由于疏水侧链暴露，可能导致紫外吸收增加。,变性与复性,变性并非完全是不可逆的变化，当变性程度较轻时，去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性(renaturation)。如核糖核酸酶中四对二硫键及其氢键，在-巯基乙醇和8 M尿素作用下，发生变性，失去生物学活性，变性后如经过透析去除尿素，-巯基乙醇，并对空气缓慢氧化使疏基氧化成二硫键，酶蛋白又可恢复其原来的构象，酶学活性也几乎全部恢复，称为变性核糖核酸酶的复性。许多蛋白质变性时被破坏严重，即使撤去变性因素也不能恢复，称为不可逆性变性。,RNase的变性与复性,盐 析(Salting Out),在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质胶体的稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。,蛋白质的盐溶和盐析,硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响,离子强度（硫酸铵浓度）,盐 析,盐溶,蛋白质的沉淀(Precipitation),蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象-蛋白质沉淀，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外加条件，不致互相凝集。然而除掉这两个稳定因素(如调节溶液pH至pI和加入脱水剂)，蛋白质便容易凝集析出。但如将溶液pH调节到蛋白质pI，蛋白质分子呈等电状态，虽然分子间同性电荷相互排斥作用消失了。但是还有水化膜起保护作用，一般不致于发生凝聚作用，如果这时再加入某种脱水剂，除去蛋白质分子的水化膜，则蛋白质分子就会互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白质脱水，然后再调节pH到等电点，也同样可使蛋白质沉淀析出。,蛋白质胶体颗粒的沉淀,（沉淀）,（疏水胶体）,（疏水胶体）,重金属盐沉淀蛋白质,蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子，易与重金属离子结合成盐。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。,生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质,蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。,有机溶剂沉淀蛋白质,可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。,不可逆沉淀,指沉淀出来的蛋白质分子，其内部结构发生了较大的改变，蛋白质已失去了原来的生物活性，即使沉淀因素消失，沉淀也不重新溶解。在蛋白质溶液中加入某些水溶性的有机溶剂，如丙酮、乙醇等，由于这些溶剂与水的亲和力大于蛋白质，破坏了蛋白质胶体外层的水化膜，并可逐步进入蛋白质的内部，有利于蛋白质的沉淀，此种作用在短时间及低温时，沉淀是可逆的，但作用时间长或温度较高时，则是不可逆沉淀。,三氯乙酸、苦味酸、磷钨酸、鞣酸等生物碱沉淀试剂，能与蛋白质阳离子结合生成不溶物,而使蛋白质发生不可逆沉淀。如：+H3N-Pr-COO-+Cl3C-COO-H2N-Pr-COO-O-CO-CCl3 Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等重金属阳离子，能与蛋白质阴离子结合生成不溶物，使蛋白质发生不可逆沉淀。例如：H2N-Pr-COO-+Ag+H2N-Pr-COOAg,加热凝固(Coagulation),将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。加热首先使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。蛋白质的变性、沉淀、凝固之间有密切的关系。但蛋白质变性后并不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定凝固。如蛋白质被强酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带有大量电荷，仍溶于强酸或强减之中。但若将强碱或强酸溶液的pH调节到pI，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物，若将此絮状物加热，则分子间相互盘缠而变成较为坚固的凝块。,蛋白质的紫外吸收,波长：280 nm引起紫外吸收的因素：主要是色氨酸(Trp）和酪氨酸（Tyr)的共轭双键，Phe在紫外光区也有光吸收。可用于蛋白质的定量测定。,波长范围：200-400 nm,蛋白质的颜色反应 I,1.双缩脲反应(biuret reaction)，蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上CONH键的化合物都呈此反应，蛋白质分子中氨基酸是以肽键相连，因此所有蛋白质都能与双缩脲试剂发生反应。2.米伦反应(millon reaction)，蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液)，蛋白质首先沉淀，加热则变为红色沉淀，此为酪氨酸的酚核所特有的反应，因此含有酪氨酸的蛋白质均呈米伦反应（5 mg/mL）。,3.茚三酮反应(ninhydrin reaction)，氨基酸与水合茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝色反应，由于蛋白质是由许多氨基酸组成的，所以也呈此颜色反应。4.黄蛋白反应，蛋白质分子中若存在含有苯环的氨基酸（如Tyr、Phe等），当其与硝酸共热时，则呈黄色，再加碱则颜色变为橙黄。这一反应称为黄蛋白反应。一般蛋白质常含有Tyr和Phe残基，因此这一反应是蛋白质较为普遍的颜色反应。,蛋白质的颜色反应 II,5.含硫蛋白质的反应，如果蛋白质分子中含有Cys或Met残基，当与碱及醋酸铅共热时，分解产生的硫遇铅盐即产生黑色的硫化铅沉淀。6.色氨酸反应，将蛋白质溶液与几滴乙醛酸混合后，再沿器壁慢慢加入浓硫酸，如果蛋白质分子侧链中有吲哚环，则两液层的界面上会出现紫色环，这个反应称为色氨酸反应，又称为乙醛酸反应或霍普金（Hopking）反应。可用来检验蛋白质或肽的分子中是否有Trp残基。,蛋白质的颜色反应 III,蛋白质定性定量分析,蛋白质的定量测定,一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，以下几种食品的蛋白质含量大约为：牛肉 20.0%猪肉 9.5%兔肉 21%鸡肉 20%牛乳 3.5%带鱼 18.0%大豆 40%面粉 9.9%菠菜 2.4%黄瓜 1.0%苹果 1.4%测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。,蛋白质分子量的测定方法,超离心法凝胶过滤SDSPAGE法光散射法渗透压法激光解吸电离飞行时间质谱(LDI-TOF-MS),1、根据化学组成测定最低分子量,用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出蛋白质的最低分子量。如肌红蛋白含铁0.335%，其最低分子量：最低分子量铁的原子量铁的百分含量100=16700与其他方法测定结果极为接近，可见肌红蛋白中只含一个铁原子。真实分子量是最低原子量的n倍，n是蛋白质中铁原子的数目，肌红蛋白n1。血红蛋白铁含量也是0.335%，最低分子量也是16700，因为含4个铁原子，所以n4，因此其真实分子量为66800。有时蛋白质分子中某种氨基酸含量很少，也可用这种方法计算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%，最低分子量为35200，用其他方法测得分子量为69000，所以其分子中含两个色氨酸。最低分子量只有与其他方法配合才能确定真实分子量。,2、渗透压法,理想溶液中，渗透压是浓度的线性函数，而与溶质的形状无关。所以可用渗透压计算蛋白质的分子量。但是实际的高分子溶液与理想溶液有较大偏差，当蛋白质浓度不大时，可用以下公式计算：/c=RT/M+Kc M=RT/lim(/c)其中R是气体常数(0.082)，T是绝对温度，是渗透压（以大气压计），c溶质浓度（g/L）。测定时需测定几个不同浓度的渗透压，以/c对c作图并外推求出c为零时的/c值，带入公式求出分子量（1-100000）。方法简单准确，与蛋白质的形状和水化程度无关，但要求样品均一，否则测定结果是样品中各种蛋白的平均分子量。,c0,3、沉降分析法,蛋白质在溶液中受到强大离心力作用时，如其密度大于溶液密度，就会沉降。用超速离心机（每分钟68万转）测定蛋白质的分子量有两种方法：沉降速度法和沉降平衡法。,沉降速度法：M=RTsD(1v)其中D是扩散系数，v是蛋白质的偏微分比容，是溶剂的密度。偏微分比容的定义是：当加入1克干物质于无限大体积的溶剂中时，溶液的体积增量。蛋白质溶于水的偏微分比容约为0.74立方厘米每克。为获得准确结果，s和D的值应外推到无限稀释。其中的R是气体常数，在采用厘米.克.秒制时，等于8.314107尔格/秒。,沉降平衡法 在离心过程中，外围高浓度区的蛋白质向中心扩散，如转速较低，二者可达到稳定平衡。此时测定离心管中不同区域的蛋白浓度，可按下式计算分子量：M=2RTln(c2/c1)2(1v)(x22x12)其中c2和c1是离轴心距离为x2和x1时的蛋白质浓度，x为蛋白质界面到旋转中心的距离，为溶剂的密度，为角速度，v为蛋白质的偏微比容。沉降平衡法的优点是不需要扩散系数，且离心速度较低（800020000转每分），但要达到平衡常常需要几天时间。,4、分子排阻层析法,层析柱中填充凝胶颗粒，凝胶的网格大小可通过交联剂含量控制。小分子物质可进入网格中，流出慢；大分子被排阻在颗粒外，流经距离短，流出快。此方法较简单，但与分子形状有关。测分子量时，标准蛋白的分子形状应与待测蛋白相同。lgMK1K2 Ve其中Ve是洗脱体积，即从加样到出峰时流出的体积，K1和K2是常数，随实验条件而定。先测定几种标准蛋白质的Ve,以它们的logM对Ve作图得标准曲线，由待测样品的Ve可求得。,5、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质电泳时的迁移率与其所带净电荷、分子大小和形状有关，加入SDS后，每克蛋白可结合1.4克SDS，将原有电荷掩盖，而且使分子变成棒状。由于凝胶的分子筛效应，相对迁移率R与分子量有如下关系：lgM=K1K2R其中K1和K2是与试验条件有关的常数，R为相对迁移率=样品迁移距离/染料前沿迁移距离。用已知分子量的标准蛋白作标准曲线，即可求出未知蛋白的分子量。有些蛋白不适宜采用这个方法，如带电荷较多的（组蛋白），带较大辅基的（糖蛋白），结构特殊的（胶原）等。,6、激光解吸电离飞行时间曲线(LDI-TOF-MS),高度纯化的蛋白质样品与有机酸混合，在靶金属表面干燥；激光发出的射线使蛋白质离子化，离子经加速后飞入自由漂移区，最后到达检测器；飞行时间与分子量成反比，与电量成正比；测定误差0.0001。,蛋白质的定量测定法,凯（克）氏(Kjeldahl)定氮法:浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3双缩脲(biuret)法:CuSO4与肽链的氨基结合Folin-Phenol法:芳香族氨基酸侧链发色紫外法:280 nm处的紫外吸收(1 OD280=1 mg/ml)Bradford法:考马斯亮兰(Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化BCA(bicinchoninic acid)法:FDA唯一认可,凯（克）氏定氮法,蛋白质的含氮量一般为15-17%，有上下浮动的差别，可以测出总氮(N)=N6.25=蛋白质含量 1833年，由Kieldhl提出定氮法，现已发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。,常量凯氏定氮法,原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵；然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。整个过程分为：消化、蒸馏、吸收与滴定。,微量凯氏定氮法,1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量由50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L,可用微量滴定管。,微量凯氏定氮蒸馏装置,自动凯氏定氮法,原理及适用范围同前 特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样品的测定。,1.测定范围：0.1-200 mg氮 2.蒸馏时间：3.5分钟/样品（30 mg氮）3.蒸馏能力：40 ml/分钟4.滴定精度：3.8 ul/步，最快40 ml/分钟5.重现性：1%相对误差（包括消化过程）6.回收率：99.5%（1-200 mg 氮）7.数据存储：400个样品8.试管排空：200 ml在2秒内完成9.试剂泵体积：0-150 ml，10 ml/级,Kjeltec 2300 自动凯氏定氮仪 丹麦,双缩脲法测定蛋白质含量,蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。在一定的实验条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540-560 nm下比色测定光密度（OD或A），可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。标准蛋白质溶液可以用结晶的牛（或人）血清清蛋白、卵清蛋白或粉末配制。,双缩脲法,原理：脲（尿素）NH2CONH2 加热至150160时，两分子缩合成双缩脲。双缩脲能与碱性硫酸铜溶液生成紫红（或蓝紫）色络和物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键 CONH，与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定范围内，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量（560 nm）。,双缩脲的形成及与碱性铜显色,Folin-酚法测定蛋白质含量,Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 酚试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5-100g 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。也称改良Lowry法。,紫外吸收法测定蛋白质含量,大多数蛋白质由于有Trp和Tyr的存在，在紫外280 nm有吸收高峰，以此可以进行蛋白质含量的测定。通常以浓度1 mg蛋白质/ml溶液的A280为1.0进行估算。若已知该蛋白质的文献值，可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。蛋白质浓度(mg/m1)=1.45 A280-0.74 A260(假设1mg蛋白质/ml溶液的A280为1.0)蛋白质含量（mg/ml）=1.55 A280-0.76 A260215 nm和225 nm的吸收差法，蛋白质的肽键在200-250 nm有强的紫外光吸收，其光吸收强弱在一定范围内与浓度成正比，且波长越短光吸收越强。蛋白质浓度(mg/ml)=0.144(A215-A225)(测定范围为20-100g蛋白质/ml),蛋白质紫外吸收定量计算,光吸收值 A 的Beer-Lambert公式:A=kcl=log(Io/I)=-log T T(透光率,%)=I/Io;k-消光系数，c-摩尔浓度，l-样品池长度;I-光强度 对混合蛋白质样品,1 OD280nm 1 mg/ml对特定蛋白质的光吸收值的理论值:A280(1 mg/mL)=(5690Nw+1280Ny+120 Nc)/M Nw,Ny和Nc分别为Trp、Tyr和Cys的数量,M为分子量Scopes的经验公式:A2051 mg/ml=27+120(A280/A205)蛋白质也可以下列经验公式定量:Protein concentration(ug/ml)=144(A215-A225)有核酸混入时,有三种近似计算法:Protein concentration(mg/ml)=1.55A280-0.76A260 Protein concentration(mg/ml)=(A235-A280)/2.51 Protein concentration(mg/ml)=0.813A230-0.0758A260,The Protein Protocols Handbook,by John M.Walker,Humana Press.,BCA法测定蛋白质浓度,碱性溶液中，蛋白质将二价铜(Cu2+)还原成一价铜(Cu+)，后者与测定试剂中BCA bicinchoninic acid，双辛丹宁(金鸡宁)生成一个在562 nm处具有最大光吸收的紫色复合物。复合物的光吸收强度与蛋白质浓度正比。此法测定范围100-1200g蛋白质/ml。BCA法操作简单，灵敏度虽与Folin-酚法相似，但它的试剂十分稳定，因此对时间控制不需那么严格。显色后，1h内读A562值无变化，抗试剂干扰的能力强。,考马斯亮兰法测定蛋白浓度（Coomassie brilliant blue,CBB）,1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法-Bradford法，根据蛋白质与CBB结合的原理设计。这种测定法具有超过其他几种方法突出的优点，得到广泛的应用。是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。CBB G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。595 nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。,Bradford法测定蛋白质的优缺点,优点：（1）灵敏度高，最低蛋白质检测量可达1 ug。（2）快速、简便，只需加一种试剂。（3）干扰物质少。缺点：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。,蛋白质的分离纯化,蛋白质分离纯化的一般原则,纯化蛋白质（酶）的最终目标：增加纯度或比活性，并使产量达到最高值。前处理（提取）粗分级（初提纯）细分级（精纯化）,蛋白质分离纯化的基本原则,选择好的材料摸清目的蛋白质的稳定性探索有效的抽提法和浓缩法建立一套层析的组合以较好的方法贮存,初提 精纯化盐析 离子交换层析有机溶剂沉淀 分子筛层析等电点沉淀 疏水/反相层析 结晶 亲和层析,蛋白质分离纯化的具体方法,必须分离和纯化蛋白质,研究蛋白质的性质、功能、氨基酸组成及序列测定，必须制备纯的蛋白质。一个细胞含有成千上万种不同的蛋白质，如何由其中分离获得其中的某个蛋白质？分离纯化蛋白质的方法利用了不同蛋白质分子之间不同的理化性质，如：许多蛋白质能高特异性地与其他生物分子结合，这些蛋白质的分离纯化就可以利用这一特性。,破碎细胞及离心,蛋白质的来源通常是生物组织或微生物细胞。分离纯化的第一步是要破碎这些细胞，将其中的蛋白质释放到溶液中粗提液(crude extract)。如果需要，可以用不同的离心力对样品进行离心，制备亚细胞组分或分离特定的细胞器。细胞器如核、线粒体、溶酶体等，它们大小不同，离心时的沉降速度不同，在不同的密度梯度中由于不同的比重，浮沉的位置不同。不同的离心可以获得不同的组分。,Subcellular Fractionation of Tissue,Fractionation,Isopycnic Centrifugation等密度（梯度）离心,分部分离(Fractionation),一旦完成提取物粗抽提或细胞器的制备，多种方法可以用于纯化其中的蛋白质。通常，利用蛋白质的大小或带电特性将混合物中的蛋白质分离成不同的组分分部分离。早期纯化的分部分离利用蛋白质的溶解度的不同，其中涉及pH、温度、盐浓度及其他因素。通常蛋白质在高盐浓度下的溶解度降低盐析(salting out)，在蛋白质溶液中增加盐，可以在一些蛋白质处于溶解时选择性地沉淀一些蛋白质。由于高的水溶性，硫酸铵(NH4)2SO4常被用于这一过程。,沉淀蛋白质的方法：盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法重金属盐沉淀法 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 加热变性沉淀法,蛋白质混合物的分离方法,利用溶解度差别的分离方法根据分子大小不同的分离方法根据电荷不同的分离方法 蛋白质与其它化合物的专一或非专一相互作用,利用溶解度差别的分离方法,1.等电点沉淀：（isoelectric precipitation）2.蛋白质的盐溶（salting in）和盐析（salting out）3.有机溶剂分级法4.温度对蛋白质溶解度的影响,根据分子大小不同的分离方法,透析（dialysis）和超(过)滤（ultrafiltration）：密度梯度（区带）离心：凝胶过滤层析（分子排阻层析、分子筛层析、凝胶渗透层析）（gel filtration，GF）：,透析（Dialysis）,含有目的蛋白质的溶液在进一步纯化前需作进一步的处理，如透析，利用蛋白质分子较大的特性将蛋白质从溶剂分离。将部分纯化的蛋白质溶液装在一个半透膜的袋子或管子中，当装有样品的透析袋悬浮于一定离子强度的大体积的缓冲液（透析液）中，半透膜允许盐及缓冲液发生交换，但蛋白质不能透过，这样蛋白质样品被保留在袋或管内，样品中的盐或其它溶质可以透过膜进行动态平衡交换，多次调换透析液可使样品中的多数盐被稀释。常被用于去除蛋白质样品中的硫酸铵脱盐（去盐）。,透析（dialysis）,超 滤（Ultrafiltration),利用超滤膜在压力下使大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法叫超滤。超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。,超速离心（Ultracentrifugation）,不同蛋白质的密度与形态各不相同，在离心力场中沉降的速度也不同，从而将其分离。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（S）表示。大体上S与蛋白质分子量成正比关系。S与蛋白质的密度和形状相关，如分子量相同，紧密颗粒的摩擦系数小沉降快；而疏松颗粒的摩擦系数大沉降慢。应用：蛋白质的分离纯化和分子量测定。,Ultracentrifugation,蛋白质的分离与分析-层析(Chromatography),蛋白质分离纯化中常用的层析,分子筛层析离子交换层析疏水/反相层析亲和层析物理吸附层析,利用分子量差异,利用电荷差异,利用亲疏性差异,利用特异性亲和,利用非特异性吸附,什么是层析-chromatography,March 21,1903,Meeting of the Warsaw Society of Natural Scientists,Mikhail Semenovich Tswett presented a lecture entitled On a New Category of Adsorption Phenomena and its Application in Biochemical Analysis.,Martin&Synge的逆流分配模型,K=1/3,K=2/3,1952年获奖,如阳离子交换层析，固体填料上带负电荷，流动相中带净正电荷的蛋白质与带净负电荷的蛋白质相比流得更慢，前者因为与固定相电荷的作用受到更大的阻滞。两种不同类型的蛋白质可以被分离成明显的两个带。蛋白质样品在流动相中的扩展受到分离蛋白质不同性质的影响及扩散的影响。当柱长增加时，带有不同净电荷的两类蛋白质的分辨率增加。然而柱长增加通常会引起样品流速的降低，样品流经柱的时间长度增加，扩散作用会引起分辨率的下降。,离子交换层析,离子交换层析原理,分子排阻层析(size-exclusion chromatography)，也称凝胶过滤(gel filtration)，根据蛋白质分子的大小进行分离。柱料是具有特定孔径大小的交联聚合物。由于较大分子的蛋白质不能进入柱料的微孔内部，流经柱的直接路径短，因而比较小分子蛋白质的移动速度快而先被洗脱出来；较小分子的蛋白质进入微孔内部，因相对较长的流经距离而移动得慢而后被洗脱。,Gel filtration chromatography,亲和层析(affinity chromatography)，根据蛋白质分子的结合特性分离蛋白质。滞留在柱料上的蛋白质是能特异性与柱料表面交联的配体结合的蛋白质。非结合的蛋白质在平衡过程被洗掉，结合到柱上的目的蛋白质用含有游离配体的溶液洗脱下来。,亲和层析需要有共价交联在层析填料上的生物配体，交联的配体必需与目标分子间有特异性的亲和结合。非结合分子被洗去后，结合在配体上的生物分子必需是可逆的，被竞争洗脱后保持生物活性。,High Performance Liquid Chromatography(HPLC),利用高压泵，加快蛋白质分子沿柱流动的速度，提高层析效果，缩短层析时间，消除扩散影响，提高分辨率。,HPLC层析系统,泵的结构,实验室用层析柱,工业用层析柱,0.5-5 cm,5-100 cm,填充物的多孔化可以减少层析压,灌注层析示意,根据蛋白质表面疏水性的不同，利用蛋白质和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用分离蛋白质。虽然科学文献中有些建议，但到目前为止，还没有被广泛接受的关于疏水相互作用层析机制的理论。,疏水相互作用层析（Hydrophobic interaction chromatography,HIC）,反相层析（Reverse Phase Chromatography,RPC）,依赖于洗脱液中样品分子与介质可逆的相互作用。起始条件主要是水相的，有利于高度有序的水结构围绕着样品分子。通常一小部分有有机修饰，常用3-5%的乙腈来“造成”湿表面。样品结合到填料上，暴露给洗脱液的疏水区域被最小化，分离依赖于样品分子在洗脱液中和填料表面达到的平衡。样品的分布依赖于填料的性质、样品的疏水性和洗脱液的组成（流动相）。,纯化工艺中不同层析技术的组合,一般准则:结合互补选择性的技术，纯化工艺应尽量采用不同层析技术(e.g.IEX,HIC and GF)减少不同层析技术间的样品处理(e.g.浓缩,交换缓冲液)尽量简单,附:Classification of Chromatography,通常一个特定蛋白质的分离纯化会用到几种不同手段的组合，每种方法的选择也是经验性的，在最终确定最有效的方法前需要进行多种方法及其组合的尝试。一般情况会出现以下不同方法的试验和最终组合。,蛋白质的分离与分析-电泳(Electrophoresis),蛋白质可以通过电泳分离和鉴定,分离蛋白质的一个重要技术（手段）是电泳，利用带电蛋白质在电场中受电场力作用发生迁移的特性电泳。电泳通常不用于大规模的蛋白质纯化，因为有更简单的方法可用，并且电泳会不可逆地导致蛋白质结构和功能的改变。电泳在蛋白质及核酸等的分析方法上特别有用。优点是蛋白质经电泳分离后可以显色，研究人员可以很快估测不同蛋白质在混合物中的数量或制备的蛋白质的纯度；电泳还可以用于测定蛋白质的一些性质，如等电点及大概的分子量。,蛋白质的电泳通常在交联的多聚物凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）上进行。聚丙烯酰胺凝胶起着分子筛的作用，能减缓电荷/质量比相近蛋白质的迁移。待分离物质的迁移可能还受分子形状的影响。电泳中，驱动大分子运动的力是电势梯度-E（场强）。分子的电泳迁移率等于粒子的电压与电场场强的比值，还等于分子的净电荷Z与摩擦系数f(frictional coefficient)（部分反映蛋白质分子的形状）的比值。=V/E=Z/f因此，蛋白质在电场中的电泳迁移是大小和形状的作用结果。,E.coli RNA Pol.,电泳现象早在1809年就已发现，用于蛋白质电泳也有100多年的历史（1907年）。1937年瑞典的Tiselius因对电泳定量方面的贡献而获得诺贝尔奖。以后琼脂电泳和纸电泳技术进一步发展，并与医学广泛结合。在20世纪60年代凝胶电泳的兴起，树立了电泳史上的一个里程碑，蛋白质电泳普及到生物学和医学的大部分实验室。30多年前，现代双向电泳的出现，奠定了目前蓬勃发展的蛋白质组学的基础；20年前，商品化的毛细管电泳突飞猛进的发展，使电泳操作实现了自动化。,1708年Reuss的实验,1930年Tiselius的装置,最早的电泳装置-移界(自由)电泳,1948年分离血清蛋白的工作获得诺贝尔化学奖，成功将血清蛋白分成5个主要成分-清蛋白、1-、2-、-和-球蛋白。,几种常用的电泳,纸电泳琼脂电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳OFarrell的双向电泳毛细管电泳,纸电泳(Paper Electrophoresis),在渗透了缓冲液的滤纸上加上电场，使物质移动的电泳法。也就是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。常用以分离性质相似的物质，如各种氨基酸的分离和稀土元素的分离等。纸电泳可分为低压电泳和高压电泳两类。低压电泳的电压一般在100-500 V，电流为 0-150 mA，高压电泳的电压一般在500-10 000 V，50-400 mA。,纸电泳的仪器装置包括电泳槽及电泳仪两大部分。电泳槽是进行电泳的装置，其中包括铂电极(直径0.5-0.8 cm)、缓冲液槽、电泳介质的支架和一个透明的罩。常见的电泳槽有水平式和悬架式等。电泳仪是提供直流电源的装置，它能控制电压和电流的输出。电泳槽内的铂电极经隔离导线穿过槽壁与外接电泳仪电源相连，电源为具有稳压