花药与花粉培养.ppt

第 五 章花药与花粉培养,第一节 花药与花粉培养的概念及意义一、花药与花粉培养的概念 花药是植物花的雄性器官，包括二倍性的药壁和药隔组织以及单倍性的雄性性细胞花粉粒。（一）花药培养：是把整个花药接种到培养基上，在离体培养条件下，分裂、分化，最终发育成完整植株的过程。花药培养的外植体是植物雄性生殖器官的一部分。,（二）花粉培养：是把花粉(小孢子)从花药中分离出米，接种到培养基上，在离体培养条件下，诱导形成单倍体的孢子体的过程。花粉培养是将花粉从花药中游离出来，成为分散或游离态进行培养。,二、花药和花粉培养的意义 作物单倍体只具有单套染色体组，本身没有或很少有育种价值，但经染色体加倍成为双倍体后，与常规育种有机结合，就会显示出巨大的优势。而作物单倍体尤其是双单倍体与分子生物学、基因工程的密切结合，可使作物育种发生革命性的变化。,(一)作物育种能迅速获得纯合体(二)物种进化研究（三）体细胞融合(四)遗传分析(五)分子生物学研究(六)植物基因克隆筛选,第二节 离体条件下的小孢子发育一、离体小孢子发育途径在自然条件下被子植物雄配子的形成过程是：孢原组织 花粉母细胞(减数分裂)四分孢子单核花粉粒(有丝分裂)二核花粉粒(1个营养核和1个生殖核)生殖核再经过一次有丝分裂形成3核的成熟花粉粒(1个营养核和2个生殖核)或称雄配子体,在离体培养条件下，由于改变了花粉原来的生活环境，花粉的正常发育途径受到抑制，由第一次分裂形成的花粉不再像正常发育过程中那样由生殖核再分裂一次形成2个精子核，而是像胚细胞一样持续分裂增殖。根据对多种植物花药或花粉培养的观察，发现小孢子的发育途径主要有对称发育途径和不对称发育途径2类。,(一)对称发育途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个相同的核，并接着发生细胞壁经小孢子分割成两个大小相似的细胞。这两个细胞倘若在以后的几次分裂中是同步的，则大多数以胚状体的形式形成花粉胚；倘若这两个细胞再次分裂不同步，其中一个停止分裂，另一个经过相当长时间的持续分裂，则形成愈伤组织；再倘若这两个细胞在进行多次核分裂的同时，发生核融合，其结果产生多倍体植株。,(二)不对称发育途径 同自然情况一样，小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，在花粉内形成一个较大的营养核和一个较小的生殖核。根据两个核进一步发育状况，该途径又分为生殖细胞发育途径、营养细胞发育途径、营养细胞和生殖细胞并发发育途径3种：,1、生殖细胞发育途径 营养细胞经几次分裂后便停止分裂，由生殖细胞继续分裂，形成多细胞的(或称多核)花粉，进一步发育形成愈伤组织或胚状体2、营养细胞发育途径。生殖细胞经几次分裂后便停止分裂，由营养细胞继续分裂，形成多细胞的(或称多核)花粉，进一步发育形成愈伤组织或胚状体3、营养细胞和生殖细胞并发发育途径。营养细胞和生殖细胞分别进行分裂，形成多细胞的(或称多核)花粉，进一步发育形成愈伤组织或胚状体。,小孢子正常发育途径与离体培养条件下胚胎发育途径比较,A:第一次有丝分裂为非均等分裂，形成一个营养核、一个生殖核 A-v:营养核重复分裂而生殖核败育 A-G:生殖核重复分裂而营养核败育 A-VG:生殖核和营养核共同分裂 C:营养核、生殖核分别或同时进行核内复制，有丝分裂后核融合分别形成二倍体、三倍体、四倍体胚 B:第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个相似的营养型核，进而重复分裂形成单倍体胚或先核融合然后重复分裂形成多倍体胚 D:自然条件下小孢子的第二次分裂、淀粉粒及萌发形成的花粉管（即正常发育途径）,二、影响离体小孢子发育的因素 影响离体小孢子发育的因素主要有供体植株的基因型、供体植株的生长条件和生理状态、供体植株的年龄、小孢子发育时期、培养基成分和培养条件等。（一）供体植株的基因型 供体植株的基因型是影响花药和花粉培养的最重要的因素之一。一般来说裸子植物比较困难，而被子植物相对比较容易；同一物种不同品种间，甚至同一品种的不同株系间，花药和花粉培养的难易程度也大不相同。,（二）生理状态 供体植株的年龄及其所处的生长条件也能影响花药对离体培养的反应。一般来说，幼年植株的花药反应能力较好。在开花末季采集的花药不但形成孢子体的频率很低，而且发生反应的时间也较迟。在水稻和小麦等禾谷类植物中，大田植株比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率高。,（三）培养基成分 花药和花粉培养所用的基础培养基以MS最为普遍，其次是B5和N6培养基，其中N6培养基特别适合水稻的花药培养。不同植物种类及品种间所需的培养基成分存在很大差异。有些植物只需很简单的培养基，例如烟草的花药培养，即使在仅含有蔗糖和螯合铁的溶液中，也可诱导部分花粉启动、形成少量的胚状体。而对于大多数植物来说，则需要较为复杂的培养基成分。,（四）药壁因子 大量的证据表明，在花粉胚发育过程中花药壁起着重要的作用。(五)花粉发育时期 在花药和花粉培养过程中，小孢子所处的发育时期是影响培养效果的重要因素。只有处于一定发育阶段的小孢子，才能对外界刺激较为敏感，从而改变其发育途径，由配子体转向孢子体方向，从而产生愈伤组织或胚状体。,不同植物花药或花粉培养的取材时期,(六)预处理 对花蕾或花药进行预处理，能有效地促进花粉愈伤组织或胚状体形成，提高培养的成功率。常用的预处理措施主要是低温处理和热激处理。低温预处理是指在培养之前，将材料置低温条件下(014)处理一段时间再进行接种。热激处理则是指将接种后的花药或花粉置于高温条件下(3035)培养一段时间，然后再移至正常温度下继续培养。,(七)培养条件 1、温度 对任何培养，细胞生长的最适温度都因物种而异。花药和花粉培养的温度一般以25为宜，但也有些植物对温度有特殊的要求。2、光照诱导愈伤组织一般不需要光照，但光照有助于器官的分化。虽然在某些植物中，无论有无光照都能形成花粉植株，但在光照下植株的形成频率较高，生长也更健壮。3、植板密度 花粉培养中，接种的花粉密度和分化培养时愈伤组织或细胞团植板密度对植株生根有很大影响。,第三节 花药与花粉培养的技术一、花药培养的方法 花药培养是指在离体条件下，对完整花药进行培养的技术。从组织器官角度来说，它属于器官培养的范畴。花药培养的方法大致可分为以下几个步骤：,(一)取材 是花药或花粉培养成功的基础。大量的实验表明，培养内含减数分裂期至双核期花粉的花药，均有可能诱导形成单倍体植株，但最佳时期则依物种类或品种不同而异，大多数为单核中、晚期。接种前，通常先用醋酸洋红染色压片法镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾大小等表观特征的相互关系。然后取适宜时期的花蕾作为接种材料。,（二）预处理 适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：烟草79，714 天；水稻710，1015 天；黑麦13，714 天；大麦3-7，714天。但低温预处理对小麦效果不稳定，有时还有负效果。,(三)材料灭菌 在无菌条件下，先将花蕾用70%酒精浸泡30秒左右，再用0.1%氯化汞表面消毒810分钟，或用1%的次氯酸钠消毒1015分钟，然后用无菌水冲洗35次。,(四)接种培养 无菌条件下将花药从花蕾中取出，直接接种到诱导培养基上。取花药时，应注意尽量避免损伤花药，以免从受伤处产生药壁愈伤组织；另外还要注意彻底去除花丝部分，因为接种与花丝相连的花药时，往往不利于花药内小孢子的启动，以及愈伤组织或胚状体的形成。花药培养的方式有固体培养和液体培养2种。花药培养一般是先暗培养，待愈伤组织形成后，再转入光照条件下培养，促进器官分化。光照时间和培养温度因培养材料而异。,（五）壮苗和移栽 花药植株非常娇嫩很难移栽，需采用逐步过渡的方式，使其适用从异养到自养，因此，要通过壮苗阶段。移栽的关键是保持高空气湿度（80%90%）12周和低土壤湿度。,选幼年树花蕾,消毒接种培养,（单核期，或单核中晚期）,花药培养流程,二、花粉培养的方法 花粉培养（小孢子培养），即未成熟花粉的培养，是指在离体条件下，对游离的小孢子进行培养的技术。与花药培养相比，操作较为复杂，从组织器官角度来说，花粉培养属于细胞培养的范畴。花粉培养的全过程除了材料的选择、灭菌与花药培养基本相同外，还包括小孢子的分离、纯化和培养3个步骤。,(一)小孢子的分离 小孢子的分离有自然散落法、挤压法和机械法等3种：1.自然散落法。花药消毒后，无菌条件下取出花药，接种在液体培养基中，当花药自然开裂、释放出花粉后，去除花药壁，继续培养或离心收集花粉后培养。,2.挤压法。花药消毒后，置无菌培养皿或小烧杯中，加入少量小孢子提取液或培养液，用平头大玻棒或注射器内管轻轻挤压，使花粉释放出来，此法简便易行，是少量分离小孢子常用的方法，但不适宜大规模游离小孢子的操作。,3.机械游离法。有磁搅拌和小型搅拌2种，前者将花粉置于装有小孢子提取液或培养液的三角瓶中，放入一根磁棒，至磁力搅拌器上，低速旋转使花粉释放出来。该法分离花粉比较彻底，但对花粉有不同程度的机械损伤。后者将花药放入小型搅拌器中，加入适量的小孢子提取液或培养液。通过高速运转，带动花蕾花药高速运动而破碎，使小孢子游离出来。,(二)小孢子的纯化 小孢子分离出来以后，需要经过纯化才能获得纯净的小孢子。纯化的一般方法是将分离出的小孢子用一定孔径的尼龙网膜过滤到离心管里，于500-1000r/分钟下离心2-3分钟，去掉上清液；再加入小孢子清洗液，重新悬浮小孢子，离心1-2分钟，重复清洗2-3次，最后倒出上清液，向离心管中加入液体培养基，用血球计数板计数，将小孢子调整到一定密度，进行分装、培养。,(三)小孢子的培养 小孢子培养主要有浅层培养、平板培养、双层培养、看护培养、悬滴培养、条件培养等方法。其中，浅层培养和平板培养2种方法较为常用。现简要介绍双层培养和悬滴培养。,选幼年树花蕾,取下花蕾（镜检）,取花药,药壁向花粉提供营养物质；通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质,消毒,过滤离心,再生,花粉培养流程,小孢子培养的优越性排除了药壁、药隔、花丝等体细胞组织的干扰，获得的再生植株都是来源于单倍体的小孢子(花粉)；花药培养中，有时会因花药中的某些物质而影响小孢子的启动分裂，而小孢子培养则不存在这种问题；小孢子培养中，由于小孢子是游离的单倍体细胞，除不受等位基因影响外，能均匀地接触外部环境条件(如化学、物理诱变)，因此是研究转化和诱变的理想材料；便于系统观察小孢子在离体条件下的生长发育过程，是研究发育极好的材料体系：小孢子培养从每个花药中能获得更多的再生植株。,三、单倍体植株鉴定及染色体加倍（一）单倍体植株鉴定方法1染色体直接计数法：通过植株的根尖或茎尖等细胞分裂旺盛处的细胞染色体直接计数是最有效的方法。2 细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。,3植株形态学鉴定法 不同倍性的植株在形态上有比较明显的差别，主要表现在子叶、真叶、花等的形状、大小和颜色，开花结实性，花粉着色能力及大小，果实形状及种子的形态等。4流式细胞仪鉴定 流式细胞仪可迅速测定叶片单个细胞的DNA含量，进而根据DNA含量曲线图推断细胞的倍性。,5生化或分子标记鉴定法（1）生化标记鉴定。主要是用同工酶对再生植株来源和倍性鉴定。（2）分子标记鉴定。可用来鉴定再生植株 来源和倍性。近年来，随着分子生物学技术的发展，不断涌现的各种分子标记技 术(如RFLP、RAPD、AFLP、SSR等)作为遗传育种的重要手段得到了广泛应用。,6杂交鉴定法 分为自交鉴定和测交鉴定。前者适用于自花授粉植物，自交后代群体分离则该二倍体为杂合二倍体，否则为纯合二倍体。有时也利用四倍体自交结实率较低的特性鉴定四倍体植株。测交鉴定适用于雌雄异株的植物，如石刁柏、啤酒花、猕猴桃等。方法是使雄株和雌株杂交，从F1分离比例来判断亲代雄株的基因型，从而判断雄亲是来自小孢子还是体细胞。,(二)单倍体植株的染色体加倍 单倍体植株弱小、不育，没有直接的利用价值，只有经过染色体加倍，使之成为二倍体的可育植株，才能应用于育种。单倍体植株的染色体加倍主要有以下3种途径。1自然加倍 在诱导形成单倍体植株的过程中，往往有一些植株会自然加倍。,2人工诱导加倍 尽管在花药和花粉培养中，单倍体可以自然加倍成二倍体，但对自然加倍率较低的一些植物来说，仅靠单倍体的自然加倍，不能满足育种实践的要求，还必须对其进行人工诱导加倍。尽管用于诱导染色体加倍的方法有多种，如摘心、变温处理等，但最有效的方法是用秋水仙素溶液处理，处理的时期可以是小孢子培养初期、不定芽分化期，也可以是单倍体植株生长发育期。,3从愈伤组织再生二倍体植株 单倍体愈伤组织培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂(没有核分裂的染色体复制)及花粉核的融合，形成二倍体细胞。切取单倍体植株的茎、叶等组织置于含有一定比例的生长素和细胞分裂素的培养基上进行培养，使其通过愈伤组织、器官分化途径再生植株，这样利用单倍性细胞的不稳定特性，经过再培养过程往往可以获得较高比例的加倍植株。,