环境化学物的生殖发育毒性及其评价本节主要内容.ppt

第三节 环境化学物的生殖 发育毒性及其评价,本节主要内容,生殖毒性及评价 发育毒性及评价,返回本章目录,一、基本概念,生殖发育是哺乳动物繁衍种族的生理过程，其中包括：生殖细胞（即精子和卵细胞）发生、卵细胞受精、着床（或植入）、胚胎形成、胚胎发育、器官发生（或器官形成）、胎仔发育、分娩、哺乳、性成熟过程。,（一）生殖发育,（二）生殖发育毒性,环境化学物对生殖发育损害作用可分为：,生殖毒性-生殖毒理学,发育毒性-发育毒理学,（三）生殖毒性,生殖毒性是指环境污染物对生殖过程的影响。生殖毒性的表现主要包括对性成熟、配子生成和转移、性周期、性行为、受精的有害作用；广义的还包括对妊娠、分娩、哺乳等的有害作用。,生殖毒理学主要研究环境化学物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害作用及其评定。广义的生殖毒理学可以包括发育毒理学。,（四）生殖毒理学,（五）发育毒性,发育毒性是指环境污染物对生长发育过程的影响。发育毒性的表现主要包括形态异常、生长发育改变、发育生物体死亡、行为功能缺陷或异常。,（六）发育毒理学,发育毒理学则主要研究从受精卵到性成熟这一发育期间环境污染物对发育体的毒性作用，也可包括对生殖细胞的毒性，如雄性或雌性介导的发育毒性。狭义的概念则主要指孕期暴露对发育体的毒性作用。发育毒理学是在畸胎学（主要是实验畸胎学）、生殖毒理学（主要是化学致畸作用）基础上发展起来的一门毒理学的分支学科。从毒理学角度而言，发育毒性作为生殖毒性研究的内容，直到20世纪80年代末才从生殖毒理学中分化出来。,二、生殖毒性及评价,(一)雄性生殖毒性,1.雄性生殖基础,精子雄性生殖细胞,结构：大小、头、尾（结构畸形）。数量：多少（数量畸形）。运动：运动启动、运动能力（能量）。指示生物：鱼等动物精子，如文昌鱼；人类精子库。生育功能自检，英国生产。,2.雄性生殖毒性,睾丸的功能主要是生成精子和合成雄性激素，精子的生成有赖于下丘脑垂体睾丸轴的调节功能。环境化学物毒性：（1）睾丸生精能力损害。（2）下丘脑垂体睾丸轴调节功能的影响。（3）对性功能的影响。,（1）对睾丸生精能力的损害,影响睾丸生精功能的典型环境化学物有：棉酚 农药（马拉硫磷和敌敌畏）工业污染物（如CS2）维生素A缺乏等,棉酚:棉酚毒性作用部位是睾丸，使睾丸内的精子、精细胞和精母细胞受损，直接作用于精子，使其活力受到抑制，作用于精子发育过程的不同阶段，最终导致精子减少或无（治疗后大部分可恢复）、不育。多种农药：马拉硫磷和敌敌畏，都能引起精子数目减少、畸形精子增多和性功能减退。,工业污染物：二硫化碳（CS2），对多种动物的睾丸有损害作用，表现为睾丸明显萎缩，精子生成障碍。重金属：铅、镉、汞、锰。均具有不同程度的生殖毒性。都能引起精子数目减少、畸形精子增多和性功能减退。,（2）对内分泌功能的影响,影响内分泌功能典型的环境污染物是铅和二硫化碳（CS2）。,铅可干扰下丘脑垂体睾丸轴的正常功能，影响促性腺释放激素(GnRH)的释放，血清中促卵泡生成激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、睾酮含量降低。有报道12 名铅作业工人血清中FSH、LH和睾酮的平均值均明显低于对照组，三种激素与血铅含量呈负相关。,二硫化碳（CS2）：在人群调查中观察到接触CS2的血清中FSH水平显著低于对照组，而LH则较对照组明显升高。一般认为LH水平增高出现的时间先于FSH水平增高和睾酮水平降低时间，所以LH水平可作为评价CS2对男性生殖系统损害的早期检测指标。,（3）对性功能影响,雄性机体性功能：包括性欲、阴茎勃起、性交、情欲高潮和射精等几个方面。雄性发育条件：正常的内分泌系统，即下丘脑垂体睾丸分泌轴的功能正常。精子的成熟、储存及输出，即有正常的睾丸、附睾、输精管、射精管和尿道。外生殖器官和附属性腺正常。环境化学物如影响上述任何一个环节，则表现出雄性不育，或称雄性生殖功能障碍。,典型物质,有机汞 易于通过血睾屏障，在睾丸中积蓄量高，影响早期精细胞，并可导致不育。无机汞 主要影响精原细胞及精细胞，使生育能力降低，此种损害作用具有可逆性。锰 可抑制睾酮的分泌，抑制生精上皮中线粒体的琥珀酸脱氢酶活性，造成大量细胞死亡。,1.对卵细胞的影响,电离辐射指可以引起物质发生电离作用的辐射，对机体的损害作用大。原始生殖细胞对电离辐射最为敏感，极易受损伤。日本原子弹爆炸地附近，50%妇女不孕。生育期女性避免放射工作或改行。,（二）对雌性生殖系统的损害作用,二硫化碳（CS2）对雌性动物性腺、胚胎均有损害作用。可引起:卵巢萎缩、原始细胞数减少、原始细胞和滤泡变性等损害作用。卵母细胞染色体畸变。,2.对内分泌功能的影响,（1）苯及同系物 苯、甲苯、二甲苯等有机溶剂在一定剂量下会造成女性或雌性动物的生殖功能损害，其机理可能是该类化合物直接作用于下丘脑，干扰垂体卵巢系统，使内分泌调节系统异常，导致月经异常。,（2）有机氯类农药 雌性大鼠慢性接触林丹时：发现幼鼠阴道开启和排卵周期延迟。血清中垂体 LH 和催乳素降低，而垂体FSH浓 度升高。垂体和子宫的质量明显低于对照组。,（3）其它毒物作用 对内分泌调节系统（下丘脑垂体性腺 轴）的影响。对子代产生影响，如畸形、死胎、功能 发育不全等。,（三）生殖毒性及评定,1.生殖毒性(1)雌性可出现排卵规律改变、月经失调或 闭经、卵巢萎缩、受孕减少、胚胎死亡、生殖力降低、不孕或不育等。(2)雄性可表现为睾丸萎缩或坏死、精子数目 减少等。,（1）研究设计 动物选择 多用性成熟大鼠 A 每组雌雄各1620只，或雌性16 20 只，雄性810只。B 接触受试物的方式可混入饲料或饮水 中，由动物摄取，也可采用灌胃或腹腔 注射。,2.生殖毒性作用的评定,剂量分组 设三个剂量组和一个对照组 A 高剂量组：以超过人类实际接触水平，能使新一代动物出现轻度中毒，死亡率不超过10%，不完全丧失生育能力。B 低剂量组：新代动物仅能出现轻微的中毒症状。C 中间剂量组：介于高剂量和低剂量之间的剂量。,（2）试验方法,三代两窝生殖试验 选用大鼠繁殖三代每代生育两窝。两代一窝和一代一窝生殖试验 基本程序与三代两窝试验法相同，但只进行到第二代F2，每代只生育一窝。,（3）观察指标,受孕率：反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况。妊娠雌性动物数 受孕率100%交配雌性动物数,正常分娩率：反映雌性动物妊娠过程是否受到影响。正常分娩雌性动物数 正常分娩率 100%妊娠动物数,幼仔出生存活率：反映雌性动物分娩过程是否正常，如分娩过程受到影响，则幼仔往往在出生4 天内死亡。出生后4天存活幼仔数幼仔出生存活=100%分娩时出生幼仔数,幼仔哺育成活率：反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力。21天断奶幼仔存活数幼仔哺育成活率100%出生后4天存活幼仔数,二、发育毒性及评价,内 容,（一）胚胎毒性（二）母体毒性（三）发育毒性评定（四）致畸作用的机理,（一）胚胎毒性,胚胎毒性(embryo toxicity)指环境化学物对胚胎或胎儿产生的毒作用。表现为：胚胎死亡 生长迟缓 功能发育不全 畸形,（二）母体毒性,母体毒性(maternal toxicity)指环境化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。母体毒性常见的有以下几种特点。,母体毒性特点,1.具有胚胎毒性作用，但无母体毒性出现 有的环境化学物具有致畸作用，且有特定的作用机理，与母体毒性无关。此种受试物致畸作用往往较强，应予特别注意。2.出现胚胎毒性作用的同时也表现母体毒性作用 此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸作用，同时也对母体具有损害作用，但两者并无直接联系。,3.不具有特定致畸作用，但可破坏母体正常生理稳态，对胚胎产生非特异性的损害作用，并造成胚胎毒性。4.仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。5.在一定剂量下，既不表现母体毒性，也未见致畸作用等胚胎毒性。,（三）发育毒性及评定,世界上很多国家和机构对环境化学物致畸作用的检验，多采用传统常规试验方法致畸试验。主要介绍：1.致畸试验 2.致畸物体内筛检试验法 3.致畸和发育毒性体外试验法 4.生殖毒性和发育毒性三阶段一代试验法 5.人群调查,1.致畸试验,致畸试验是检查受试环境化学物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形的动物试验。动物选择 剂量分组 动物交配处理 胎仔检查 结果评定,（1）动物选择原则 食性和对受试物代谢过程与人类接近。体型小、驯服、容易饲养、繁殖及价廉。妊娠过程较短，每窝产仔较多和胎盘构造与人类接近。首选大鼠，此外可采用小鼠或家兔。狗、猴现已少用于教学、临床研究。,（2）剂量分组原则及方法 剂量分组一般原则：A 要求找出最大无作用剂量和致畸阈剂量。B 应不影响母体生育能力，避免和减少大批流 产、胚胎死亡、母体死亡。,剂量分组方法：A 剂量组设3个：高、中、低组 最高剂量组：应为可引起母体轻度中毒，死亡不超过10%；最低剂量组：不应观察到任何中毒症状；中间剂量组：可允许母体出现某些较轻的中 毒症状。,B 对照组设2个 对照组：阴性对照和阳性对照组 常用的阳性对照物有维生素A、乙酰水杨酸、敌枯双、五氯酚钠及脒基硫脲等。,C 每组所需动物数：大鼠或小鼠1220只，家兔812只，狗等大动物34只。,（3）动物交配处理,将性成熟雌雄动物按1:1或2:1比例同笼交配。每日将受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。凡发现阴栓或检出精子，即确定为受孕“0”日。,接触受试物的方式：混入饲料或饮水喂养 灌胃 腹腔注射给受试物时间：根据观察指标的需要，如器官畸形。,（4）染毒,（5）胎仔检查,大鼠在受孕后第1920天，小鼠第1819天，处死取胎。记录活产幼仔、死胎以及吸收胎，大鼠还应 取出卵巢，记录黄体数。,活产胎仔取出后，检查性别，逐只称质量，并按窝计算平均体质量。畸形检查：A 外观畸形，如露脑，无尾和短肢等。B 内脏及软组织畸形。C 骨骼畸形检查。,（6）结果评定,在致畸试验结果评定时，主要计算畸胎总数和畸形总数。常用的评价指标有:.活产幼仔平均畸形出现率.畸胎出现率.母体畸胎出现率,.活产幼仔平均畸形出现率：畸形总数活产幼仔平均畸形出现率=100%活产幼仔总数,.畸胎出现率：出现畸形的胎仔总数 畸胎出现=100%活产胎仔总数,.母体畸胎出现率：即出现畸形胎仔的母体在妊 娠母体中所占的百分率 出现畸胎的母体数 母体畸胎出现率 100%妊娠母体数,d.计算各组雌性动物的受孕率、平均体质量和 妊娠增长体质量数。e.对于胎仔，可计算每窝的活产胎仔数、死胎率、吸收胎率、平均胎仔体质量、活产胎仔雌雄性 别比等。,2.致畸物体内筛检试验法,在受孕小鼠或大鼠进行。利用孕鼠筛检环境化学物是否具有致畸作用。观察外观畸形，如胚胎致死、生长迟缓等发育毒性表现。还可确定生长发育迟缓是否有可逆性。,3.致畸和发育毒性体外试验法,细胞、组织和器官培养，建立了全胚胎培养、器官如肢芽（limb bud）、腭片、骨骼、肺、牙齿、肾等培养和细胞培养的体外试验法。,全胚胎培养法,将试验动物的全胚胎在一定的培养基中进行培养，观察在接触受试物的情况下，是否呈现致畸作用以及发育毒性。胚胎来源：大鼠、小鼠、家兔；鸡、鱼和蛙类等。观察指标：A 胚胎存活率；B 肉眼及组织学形态异常变化。例如，胚胎外形、体节数、卵黄囊、神经管、上下颚、眼、耳、心脏和肢芽的发育情况。,器官培养法,将胚胎或胎仔组织、器官或器官的一部分在体外培养，观察环境化学物对其发育过程的影响。常用方法 对啮齿动物肢芽培养方法。观察指标 细胞增殖和分化、核酸和蛋白质含量，肢芽大小和形状、软骨形成、胶原和蛋白聚糖的生物合成可对发育过程进行定量评定。,细胞培养法,细胞培养法：传代细胞株(cell line)和原代细胞。原代细胞对致畸物较为敏感，与机体细胞实际情况相符合。在致畸物作用下，可观察到细胞毒性作用和分化过程。常用原代细胞有大鼠、小鼠和鸟类的肢芽细胞，神经元细胞等。人脑细胞、成纤维细胞、平滑肌、心肌、骨细胞等细胞分离和培养。,4.三阶段一代试验法,生殖毒性和发育毒性采用三阶段一代试验法：三阶段一代繁殖试验，也称三阶段生殖试验(three segment reproduction test)。第一阶段试验：生育力与生殖功能试验。第二阶段试验：致畸作用和胚胎毒性的评定。第三阶段试验：围生期及出生后发育情况试验。,第一阶段试验,第一阶段试验：即生育力与生殖功能试验。动物选择：性成熟雄雌鼠，每组雌性动物20只，雄性10只，先开始接触受试物60天，然后雌鼠接触14天，并进行交配。接触期：包括全部精子发生期和排卵期。,剂量：分为23个剂量组和1个对照组。A 高剂量组：可引起母体轻度中毒，不能出现严重中毒症状或10%以上的死亡。B 低剂量组：只引起生理效应、药理学效应或对组织中某些酶的活力造成一定的影响，但不应出现中毒症状。C 中间剂量：与高剂量和低剂量成等比级数，只出现轻微的中毒或无任何症状。,观察指标 将孕鼠(10只)处死，剖开子宫，观察记录：A 黄体数、着床数和吸收胎数。B 分别计算着床前死亡率和着床后死亡率。,第二阶段试验,第二阶段试验：致畸作用和胚胎毒性的评定。每组雌鼠20只，在妊娠6 15日接触受试 物。自然分娩前1天，处死孕鼠，取出胎仔，称质量、鉴定性别并检查内脏和骨骼有无 畸形。,第三阶段试验,第三阶段试验：围生期及出生后发育情况试验。可以评定受试物对胎仔发育后期、母体妊娠、分娩和授乳以及幼仔在新生期间存活和生长发育的影响。分组：设23个剂量组和一个对照组。观察指标：受孕率、幼仔性别比例或雌雄两性各占幼仔总数的百分率、出生存活率、哺育成活率等。可发现第二阶段试验中未被检到的畸形。,5.人群调查,人群调查观察指标详细方法可参照有关的临床诊断检验指标，主要观察指标有：,（四）致畸作用的机理,致畸作用的机理主要包括以下几个方面：基因突变和染色体畸变生物合成的原料和能量不足细胞毒作用酶的抑制对细胞膜损伤非特异性发育毒性作用母体及胎盘的正常功能受到干扰,1.基因突变和染色体畸变,基因突变和染色体畸变表现为：基因突变所致的畸形具有遗传性，引起的畸 形约占5%。染色体畸变常导致胚胎死亡、畸形、功能障 碍，引起的畸形约为10%。,2.生物合成的原料和能量不足,生物合成的原料和能量不足主要有：母体中维生素和无机盐等营养状况失调、缺氧等，叶酸缺乏、维生素A缺乏与畸形 有关。,药物致畸：反应停，导致严重畸形。镁、锰、叶酸、泛酸等缺乏影响胚胎正常生 长发育。RNA 和DNA合成前体物的不足，如嘌呤类、嘧 啶类等不足。很少发生，补核酸无益。,3.细胞毒作用,细胞毒作用主要表现为：在器官发生期细胞增殖速度极高，如接触一定剂量的环境化学物，可表现出细胞毒性作用。有的环境化学物可干扰细胞分化过程的某一种特定阶段、步骤或环节而引起畸形。,4.酶的抑制,目前已知影响酶类活性并可致畸的环境化学物有：胞嘧啶阿拉伯糖：抑制DNA 聚合酶。5-氟尿嘧啶：抑制胸苷酸合成酶。羟基脲：抑制核苷二磷酸还原酶。叶酸盐拮抗剂：抑制二氢叶酸还原酶。6-氨基烟酰胺：抑制葡糖6磷酸脱氢酶等。利尿剂乙酰唑胺：抑制碳酸酐酶可引起大鼠的特异肢体畸形。,5.对细胞膜损伤,对细胞膜损伤可能有：在细胞膜正常结构以及渗透性等生物物理性质改变的情况下，也可出现畸形。高浓度的维生素A破坏胚胎细胞膜的超微结构。影响细胞正常功能及增殖过程，导致畸形。,6.非特异性发育毒性作用,非特异性发育毒性作用特点对全部胚胎组织细胞基本生命现象的干扰。损伤线粒体功能 抑制线粒体呼吸 ATP的产生、抑制细胞色素氧化酶活性 降低细胞能量供给 引起胚胎生长迟缓,7.母体及胎盘的正常功能受到干扰,母体及胎盘的正常功能受到干扰可导致胎儿畸形,即生殖与发育毒性是无数损害以及发生在出生前和出生后的成百上千干扰过程的综合表现。,小 结,第三代 第二代 精 子生殖细胞发生 受精卵 胚胎发育 胎仔 新生仔 幼仔 性成熟 卵细胞 生殖毒性(受孕)发育毒性(生长、畸形)生殖发育毒性(广义:生殖毒性),返回本章目录,返回总目录,