核酸的分离与提纯.ppt

第九章核 酸 的 制 备,第一节核酸制备的基本原理,核酸的种类 脱氧核糖核酸（DNA）：细胞核，单链或双链 核糖体RNA 核糖核酸（RNA）转运RNA 信使RNA,细胞质，单链或双链,但无论哪核酸，在生物体中一般以核蛋白的形式存在，因此，为了提取制备核酸，必须将核蛋白解联（即利用接联剂将核蛋白裂解为核酸和蛋白）并去除蛋白，同时必须维持核酸的天然性状，不使核酸发生变性或降解，操作上尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各种不利因素对核酸的破坏，同时要求去蛋白迅速彻底。为了保证分离核酸的完整性及纯度，在实验过程中，应注意以下条件和要求：,（1）尽量避免化学因素对核酸的降解 过酸或过碱以及其他化学因素将破坏多聚核苷酸链的磷酸二酯键，使核酸降解；核酸（特别是RNA）在碱性溶液中十分容易降解.因此抽提介质的pH常以为宜。,（2）减少物理因素对核酸的降解 物理因素主要是机械剪切力，包括强烈震荡、搅拌、细胞突然置于低渗溶液中，以及让溶液快速通过狭长的孔道；其次是冻融、高温煮沸和辐射等，均将导致核酸的降解。机械剪切力主要破坏大分子量的线性DNA分子，而对分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，破坏相对较小。,(3)防止核酸的生物降解,细胞内外各种核酸酶可作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，使其降解；DNA酶需要Mg 2+、Ca 2+的激活，因此实验中常加入EDTA、柠檬酸盐，以络合核酸酶作用时所必需的Mg 2+离子，以抑制DNA酶的活性；制备RNA则需克服核糖核酸酶（RNase）的降解作用。因为RNase不但分布广泛，极易污染，而且耐高温，即使加热到蛋白变性，Rnase的活力也不会完全丧失，且具有惊人的回复力，而细胞内的核蛋白又总是和它联在一起，若去除不彻底，它将部分恢复活力，导致RNA降解。,生物降解是RNA提取过程的主要危害，储存的RNA制品也不例外，因此，为了抑制核酸酶的活性，一般在低温下（4或0，甚至-20 左右）进行。进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料置液氮中或-80 冰箱保存。,分离纯化核酸总的原则,一是应保证核酸一级结构的完整性，这是研究核酸结构与功能的最基本要求；二是要排除蛋白质、脂类、糖类等其他物质的污染。纯化的样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子；蛋白质、脂类、糖类等的污染应降低到最低程度；无其他核酸的污染，如提取DNA时，应去除RNA。,2、载体DNA分离 载体DNA 感染或转染细胞（病毒型）转化细菌细胞（质粒型）分离病毒颗粒 培养转化细胞、收集菌体 病毒载体DNA分离与纯化 破碎细胞 质粒DNA分离与纯化,3、DNA片段的分离 DNA 限制酶切 凝胶电泳分离 特定 DNA片段的回收4、质量评估 1）凝胶电泳 2）光密度值测定 3）限制酶切分析,第二节 核酸制备的基本方法,核酸制备的步骤,（1）抽提组织或细胞的破碎、消融。抽提核酸必须事先将生物材料破碎或消融，这关系到核酸回收率的高低。破碎与消融组织细胞，通常有使用匀浆器、捣碎器的机械方法以及温和的反复冻融法，使用表面活性剂或各种酶处理的方法。,（2）抽提核酸，去除与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类，去除盐、有机溶剂等杂质，以及去除其他不需要的核酸分子；（3）核酸的精制纯化。,一、细胞的破碎,一般动物组织的细胞膜较脆弱，易破碎，而植物和微生物的细胞比较牢固。细胞破碎的方法很多，可根据组织特性和核酸分离目的加以选择。,1物理方法,(1)机械碾碎 对于动物组织(如鼠肝、兔肝等)，一般多采用匀浆的方法。即将组织剪碎置研钵中，研碎。为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。但要注意石英砂对有效成分的吸附作用。用匀浆器处理，也能把动物细胞破碎，此法较温和，适于实验室应用。若需大规模生产，则可用电动研磨法，酵母、植物组织的细胞破碎也可用此法。,(2)组织捣碎器法,是一种剧烈的破碎细胞的方法。捣碎器(8 000-10 000 r/min)处理3045s，植物和动物细胞能完全破碎。若用它破碎酵母菌和细菌的细胞，则需加入石英砂方才有效。在捣碎期间必须保持低温，以防温度升高引起有效成分变性，同时捣碎的时间不宜太长。,(3)超声波法,是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。由于细菌的外部有一层细胞壁，破壁较为困难，因此用超声波处理细菌和酵母的时问要长一点。有些菌体破碎需要5l0min或更长，如果在细胞浮液中加石英砂则可缩短时间。为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。,(4)压榨法,是一种温和、彻底破碎细胞的方法。即用高压迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于细胞直径的小孔，致使细胞被挤压破碎。,2溶胀和自溶,(1)溶胀,概念：在低渗溶液，如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子将大量进入细胞，致使细胞膜膨胀破裂的现象称为溶胀。步骤：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出至室温下(或40左右)迅速融解。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高胞液盐浓度的同时，发生溶胀，以致破碎。,(2)自溶,概念：细胞结构在本身所具有的各种水解酶作用下，发生溶解的现象称为自溶。注意：应用此法时要特别小心操作，因为水解酶不仅可破坏细胞壁、细胞膜，同时也可使某些有效成分在自溶时分解。,3化学处理,用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯等)或表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)处理细胞时，可使细胞壁和细胞膜的结构部分溶解，导致整个细胞破碎。,4生物酶降解,生物酶有降解细菌细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消融，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。,二、核酸提取的基本方法,1去垢剂(SDS)法,SDS(sodium dodecyl sulfate)：即十二烷基硫酸钠，是一种有效的细胞消溶剂、核酸酶抑制和蛋白变性剂，也是一种去污剂。去垢剂法由Marmur于1961年创建，最早用于从细菌中提取DNA。,原理：抽提核酸时利用SDS的非极性基团破坏蛋白质分子的次级键，使蛋白质变性，达到使核蛋白解联、变性和去除蛋白的目的。变性后的蛋白仍留在溶液中不生成沉淀。为了将同时存在于溶液中的核酸和蛋白分开，可在室温条件下加入1/2体积饱和硫酸铵使蛋白沉淀。特点：此法得率高，对核酸影响小，但制品中仍残留微量蛋白。SDS在低温或有两价金属离子或钾离子存在时将形成沉淀，使用时应该注意。,2酚抽提法,酚也是一种蛋白表面变性剂。球状蛋白在水溶液中其亲水性氨基酸残基的侧链位于外侧，疏水性氨基酸的侧链位于内侧，酚法于1957年为Kirby建立，最早用于DNA的抽提。,酚的作用机制:,可能是插入蛋白结构的内部，破坏各种氨基酸残基侧链基团问的次级键，使蛋白的结构翻转，即原来存在于内侧的疏水性氨基酸残基侧链转向外侧，而外侧的亲水性氨基酸残基侧链则转向内侧，导致蛋白质变性。酚还能使核酸酶失活。,3CTAB法,CTAB(eetyltriethylammonium bromide):即十六烷基三乙基溴化铵，是一种去污剂。特点：此法相对较为简单，特别适用于植物材料，已成功地从一系列的单子叶和双子叶植物中提取出总DNA。此法提取植物DNA时，可采用氯仿/异戊醇反复抽提去蛋白，通过高盐缓冲液的选择性沉淀去除多糖类杂质.,机制：,可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当溶液盐浓度降低到一定程度(0.3mol/INaCl)时，却会从溶液中沉淀出来，因此通过离心便可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将此复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，因CTAB溶解于乙醇，离心后即可得DNA沉淀。,优点,既适用于新鲜的植物，也可用于经脱水处理的材料，能够很好地去除多糖类杂质，对于含糖较高的植物材料可优先采用。另一优点是提取的前期能同时得到高含量的DNA及RNA，如果后续实验对两者都有需要，则可分别进行纯化。如只需要DNA，则加入RNase除去RNA；若只需RNA，则加入DNase去掉DNA。该法制得的DNA虽然纯度不很高，但仍能满足限制性内切核酸酶分析、PCR反应以及DNA重组克隆的要求。,4浓盐法,机制：高浓度的盐可以破坏核酸和蛋白质之间的次级键，使核蛋白解联。一般先用lmol/L NaCl或lmol/L NaClO4进行抽提，再加入氯仿/异戊醇离心去蛋白，最后用甲醇或异丙醇使核酸沉淀。其中的氯仿可以使蛋白表面变性，帮助去蛋白。异戊醇可以消泡以维持离心层的稳定。特点：该法对核酸的损伤较小，但由于去除蛋白不够彻底，常与其他方法结合使用。,5高通量的RNA分离技术,(1)微量移液法(micropipeting),由Karrwer等人于1995年建立的一种方法。特点：此法借助毛细管或微量移液管直接提取细胞的内含物，进行RNA抽提。,操作过程,用激光移液管拉伸器(1aserpipette puller)将毛细石英管拉成孔径为l0um的微量移液管，将其顶端弯曲23，以便穿透细胞壁。微量移液管被安装在连接了气泵的微操纵器上，通过负压将大约1ul RNA提取液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0；500mmol/L LiCl；10mmol/L EDTA；1%SDS；5mmol/L DTT)压入微量移液管。装有提取液的微量移液管被降低到叶片表面，微量移液管顶点的那一小滴提取液在275kPa气压作用下被排出.,一旦微量移液管尖端被清空后，立即供给1.3kPa的负压，这时微量移液管就插入到目的细胞内。一经插入，细胞内含物就被吸进微量移液管。可以明显地看到，细胞立刻瘪了下去。然后，微量移液管离开细胞，内含物被注入到10u1 RNA提取液中，用69kPa和1.3kPa正、负压反复作用，以便将微量移液管顶端漂洗干净。此法可直接从叶片的表皮细胞、防御细胞以及叶肉细胞中提取mRNA，而叶片却不受到损伤。,随后，再加入10u1 RNA提取液，其中含有50ug连接了oligo(dT)-的磁力珠，混合均匀，22下静置l0min。再用2ou1 1倍的反转录缓冲液(50mmol/Ltris-HCl，pH8.3；75mmol/L KCl；3mmol/L MgCl2；10 mmol/L DTT)洗两次，即可将结合在磁力珠上的mRNA洗脱下来。,(2)激光微解剖法(1asercapture microdissection，LCM),该法是将一块被冷冻或被石蜡包埋的组织切成薄片，然后所需要的部位被激光解剖下来，再利用黏膜通过静电作用迅速地将其吸附，并立即转移到RNA提取液中。,优点：,它减少了对组织的处理，可避免RNA表达轮廓(profile)的改变；因为某些实验，特别是对时钟基因的研究，时间因素至关重要，采用此法可减少采样时间对实验的影响。,(3)原生质体分离法(protoplasting and sorting),特点：是一种快速而准确地从分生组织的细胞中提取RNA的技术，已应用于拟南芥根系全球性基因表达图谱的制作。原理：首先需将荧光蛋白基因转入受体细胞，用酶处理破壁后，通过紫外照射使那些表达绿色荧光蛋白的细胞产生荧光，再通过荧光感受分离仪(flurescence-activated cell sorter，简称FACS)将其从特定组织或区域中分离出来，进而制得RNA,三、核酸的浓缩和沉淀,1核酸的浓缩,若溶液中DNA含量低，而且容积较大时，常需进行浓缩，以便进一步沉淀和纯化。常用的核酸浓缩方法是真空干燥法。此法比较温和，特别适用于小量样品的浓缩。此外，还有以下两种方法：,(1)丁醇抽提浓缩法,正丁醇或仲丁醇能吸收大量水，而DNA不溶于丁醇。利用该特性，向DNA溶液中反复加入等体积正丁醇或仲丁醇，振荡混合后离心，去除有机相，可显著减少DNA溶液的体积并浓缩DNA。,(2)聚乙二醇(PEG),水沉淀法聚乙二醇同样具有吸水能力。将DNA溶液装入透析袋，包埋在聚乙二醇(分子量6 00012 000为宜)中，聚乙二醇吸水液化，同时DNA溶液体积减小、可通过更换PEG干粉达到浓缩的目的。,2核酸的沉淀,沉淀是浓缩核酸最常用的方法。其最大优点是通过沉淀来改变和重新调节核酸溶液的浓度，并可去除溶液中某些盐类和杂质，在一定程度上将核酸纯化。核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，它与钠、钾、镁形成的盐在多种有机溶剂中不溶解，也不会变性。常用的有机溶剂有乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。,(1)常用于沉淀核酸的盐类及其浓度,1)NaAc：沉淀DNA、RNA最常用的盐类，终浓度为03mol/L(pH5.0)。2)NaCl：对于含有SDS的DNA样品是优先选用的试剂，终浓度为0.2 mol/L。3)NHAc：4种dNTP在NHAc溶液中均具较高的溶解度，通过乙醇沉淀DNA，可去除大部分dNTP。,4)KAc：沉淀效果与NaAc相同。终浓度为0.3 mol/L。但核酸的钾盐很难溶于含SDS的溶液，若在下一步选用含SDS的缓冲液溶解核酸沉淀时，则不宜选用此法沉淀核酸。5)LiCl：在乙醇中溶解度非常好，在70乙醇中不与DNA共沉淀，且高浓度0.8mol/L)时可直接沉淀大分子RNA(包括rRNA、mRNA)，故常用于RNA的沉淀。,6)MgCl2：Mg2+是核酸沉淀中的有效离子，当核酸浓度低于0.1ug/ml或其长度小于100个核苷酸时，加入l0mmol/L的Mg2+可明显提高核酸沉淀的回收率。Mg2+对核酸的沉淀并不需要低温条件。即使在室温条件下，10min之内也比NaAc在0时沉淀DNA的效率高2倍。,(2)沉淀核酸的有机溶剂,1)乙醇：沉淀DNA一般首选乙醇，它对盐类沉淀较少，含在DNA沉淀中的少量乙醇易被蒸发去除，不影响后续的实验。在适当的盐浓度下，两倍样品容积的乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需将乙醇用量增至2.5倍。,优点是所需的用量较少且速度快，适用于浓度低而体积大的DNA沉淀。0.541.0倍的异丙醇可选择性地沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀，一般不需在低温条件下长时间放置。缺点是易使盐类与DNA共沉淀，在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以通常要用70乙醇漂洗DNA沉淀数次.,(2)异丙醇:,(3)聚乙二醇(PEG)：,可用不同浓度的PEG选择沉淀不同分子量的DNA片段。应用PEG 6 000进行沉淀时，其使用浓度与DNA片段的大小成反比。PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L NaCl或10 mmol/L MgCl2。除去DNA沉淀中PEG的最简单有效的办法是用70的乙醇漂洗2次。,(4)精胺(spermine)：,精胺不是有机溶剂，但可快速有效地沉淀DNA，适用于少量DNA的纯化。原理:精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分子分开，达到纯化DNA的目的。对于大于60bp的DNA片段，其浓度在0.1100ug/ml左右，也有很好的效果。沉淀DNA的要求是溶液中无盐或低盐(小于0.1mol/L)，最后可用70的乙醇漂洗2次以去除DNA沉淀中的精胺。,(3)核酸沉淀的离心力与离心时间,大多数DNA的沉淀在04、12 000g离心10min即可。若DNA片段小于100个核苷酸时，则需要超速离心。对于pg水平的核酸沉淀，应加入tRNA作为载体共沉淀。,四、核酸的纯化,方法:很多，如超速离心、柱层析、免疫沉淀、凝胶电泳等。实验室最常用的纯化方法:酚/氯仿抽提法。该方法的标准程序是用酚抽提一次，酚/氯仿(1:1)抽提一次，氯仿抽提一次。如果情况需要可再重复几次。基本原理:是通过交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂来增加去除蛋白质的效果。,1低分子物质的去除,可以通过加入乙醇或用盐溶液选择性沉淀进行分离，也可以通过透析除去。例如:在醋酸根离子存在下加入乙醇，或在高浓度的盐溶液中，或于低温下的33%硫酸铵介质中，高分子量的RNA都可以沉淀。,高分子物质主要指蛋白质和黏多糖.,2高分子物质的去除,去此类高分子物质常用的方法有:如果核酸不是采用酚法制备的，可在对氨基水杨酸等化合物存在的条件下，将核酸制品连续用苯酚进行处理，此时DNA和RNA均进入水相，蛋白质沉淀留在酚相。然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，也可以用酚或SDS反复摇荡抽提。如果是用酚法制得的核酸，则大部分蛋白质已被除去，若要进一步除去其中的微量蛋白，可用氯仿/异戊醇或辛醇振荡抽提，同时加热处理使蛋白质凝固形成沉淀，离心分离，核酸即留在溶液中。,第二个方法是Kirby创建并经Ralph和Bellamy等改良的有机溶剂法。即在pH8的1.25mol/L磷酸缓冲液中，用2-甲氧基乙醇抽提，多糖溶于水相，核酸在有机相，加入CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)沉淀核酸，然后在70%乙醇中用醋酸钠处理，以钠盐的形式回收核酸。此外，也可以用钙盐沉淀DNA，再用草酸钾处理形成DNA钾盐回收，然后用离子交换层析法吸附DNA使之与多糖分离。,3不同类型核酸的分离,通常可采用酶处理、有机溶剂抽提、盐分步沉淀和密度梯度离心等方法。从DNA中除去RNA的有效方法是利用RNase选择性地降解RNA。但由于RNase中常含有极微量的DNase，因而必须先将RNase试剂于80100)加热处理510min。反之，为了从RNA制品中除去DNA，可加入DNase降解DNA，加入的酶则利用酚法除去。其他除去DNA的常用方法是苯酚抽提法。,4同类核酸的分离,在初步纯化的RNA制品中，常含有各种RNA和某些降解RNA的混合物；在DNA制品中则往往含有变性或降解的DNA，通常多采用梯度离心、电泳、柱层析及反复萃取抽提等方法进一步纯化或分级分离。,五、超离心技术在核酸分离中的应用,核酸的分离和纯化，通常采用密度梯度离心法。密度梯度离心是一种带状分离法。密度梯度离心法包括密度梯度差速离心、等密度离心和浮力密度梯度离心。梯度溶液所使用的成分有蔗糖、甘油、氯化铯、氯化铷、右旋糖酐和蔗糖多聚物等。这些物质本身对核酸、蛋白质等具有化学惰性，因此不会导致其分子间的聚集，而且由于这些物质的黏性大，可以维持重力的稳定性，防止由于局部温度变化或机械振动所产生的对流,起着稳定离心液保证分离效果的作用.,第三节 DNA与RNA的制备,一、供体DNA的分离与纯化 要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物.1、基因组大小：,染色体细菌 33004200kb酵母 15,000 kb果蝇 1.28x105 kb人 3x106 kb植物 2x1051x108 kb 天花病毒 288 kb痘病毒 196 kb质体 几100以上kb,线粒体 藻类 线状 15kb酵母 环状 1978 kb植物 环状 100150 kb动物(扁虫到人)环状 1518 kb锥虫 网状 6000 kb(幼体)短膜虫 网状 30,000 kb(幼体)(Kinetoplast）,叶绿体双子叶植物 121（菠菜）154kb（豌豆）单子叶植物 151（玉米）182kb（浮萍）藻类 132（裸藻）191kb（衣藻）,*两种方法比较：CsCl法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速离心机。苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分子断裂。若 小心操作，所获DNA亦符合要求。*上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤.可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。.使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心.使RNA分离：RNase处理或超速离心.使DNA与其它可溶物分离,二、载体DNA的分离与纯化,1、质粒载体DNA的分离 关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开 原理：质粒DNA比染色体DNA 小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型.,方法：.超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型.变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于ss环状病毒DNA RF型的分离,质粒DNA的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）,2、噬菌体载体DNA的分离,纯净病毒颗粒 病毒载体DNA M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法。,二、RNA的分离与纯化1.制备RNA的关键-防止内外源RNase的作用1)RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围;抗高温严寒(065均具活性）；抗变性剂2)解决办法：外源RNase高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套。内源RNase高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等。,2.总RNA的制备,根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：1）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法,其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。,3.多聚核糖体RNA的制备 1)多聚核糖体的分离 超速离心法（30-40万g，离心2-3 h）镁盐沉淀法（0.1 M Mg+）分级分离法分离特异性多聚核糖体,i.结合与游离核糖体的分离,这种方法可避免溶酶体破裂.ii.核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的多聚核糖体iii.核糖体免疫沉淀法*直接免疫沉淀法 新生肽链+抗体 蔗糖密度梯度离心*间接免疫沉淀法 新生肽链+抗体+抗-抗体（二抗）不可溶复合物 离心分离,*免疫亲和层析法 新生肽链-抗体复合物 不溶性交联抗原基 质亲和层析柱吸附 洗脱免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为1%的mRNA，但必须使用高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶2)多聚核糖体RNA的分离纯化多聚核糖体+SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提,4.RNA的分级分离1)分子量大小分级分离 i.蔗糖密度梯度离心 ii.凝胶电泳2)核酸序列分级分离 i.分子杂交法：适用于同源性很高的RNA的分离DNA分子变性 结合到NCF RNADNA杂交 洗涤 洗膜 乙醇沉淀,ii.亲和层析法：低聚dT纤维素:用于poly(A)较长的mRNA；多聚U琼脂糖:用于poly(A)较短的mRNA（20A）RNA进样吸附 洗涤 洗脱 收集260nm处吸收峰样品 乙醇沉淀iii.无poly(A)mRNA的分离纯化多聚核糖体 核糖体亚基+mRNP 离心 mRNP 蛋白酶K mRNA 低聚（dT）纤维素层析 洗出液乙醇沉淀（无多聚A mRNA）,第四节核 酸 电 泳,1.种类 1)按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼脂糖和低熔点琼脂糖)2)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶;竖式/聚丙烯酰胺凝胶3)两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易 2.用途 琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。3.凝胶电泳的一般程序 制胶 点样 电泳 染色 观察,二、DNA电泳,1.DNA分子种类 1)线状DNA单链与双链，ss-DNA电泳时要注意局部区域形成ds-DNA，造成迁移距离不确定 2)环状DNA-单链（如M13mp）和双链（质粒DNA）3)线状ds-DNA电泳:使用频率最高的一种电泳,这类DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：i.分子量 的大小:迁移距离与分子量的常用对数成反比 ii.凝胶浓度:浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量DNA,iii.电压:低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，不同大小DNA片段迁移率增大是不同的。iv.碱基组成与温度:不受影响,温度高可导致DNA带变形或解链。,4)环状ds-DNA电泳:常用于质粒DNA的初步鉴定5)线状ss-DNA电泳 链分离凝胶：化学定序时，用于单链分离。DNA双链互补，但组成不一样，仍可分离（机理不详），电泳时形成三条带：变性双链，两条单链。,核酸定序凝胶(染料指示剂)：为避免局部区域产生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）,三.RNA凝胶电泳 方法：不同的RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。1.乙二醛/二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作用发生 步骤：RNA+10mM羟甲基醛和50%DMSO混合 50、1 h变性 点样 电泳 染色 观察 2.羟甲基汞法 原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。步骤：RNA+10mM羟甲基醛 点样在含4mM羟甲基醛的琼脂糖凝胶上 电泳 染色观察,3.甲醛法步骤：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺 点样在含2.2M甲醛琼脂糖凝胶上 MOPS缓冲液电泳 染色观察其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳.4.三种方法的比较 第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的RNA样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。,五、蛋白质电泳,方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS-PAGE。差别：有无变性剂用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化）SDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。,六、核酸片段的分离与回收 1.方法 用于DNA、RNA以及蛋白质的回收 1)电洗脱法:利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其它介质中；2)滤纸法 核酸凝胶染色 长波紫外光确定位置 在分离带前方切一口子并插入滤纸条(其背面覆盖透析袋膜)电泳至DNA带全部进入滤纸条 洗脱DNA 纯化、沉淀 3)透析袋法切下含DNA带琼脂块 放入透析袋，封口 放入电泳槽 电泳23小时至全部DNA离开凝胶块 反向电泳1分钟 取出DNA液 纯化、沉淀 4)冻融法 5)酶解法,回收DNA方法,影响核酸电泳的因素,(1)核酸的理化性质 核酸的电荷量、分子大小、分子的空问构象等决定了不同的核酸分子具有不同的迁移率。对于线状双链DNA分子，在凝胶电泳中，分子量的对数值与泳动率成反比关系。一般双链DNA基本上不存在影响迁移率的复杂构象，但分子的空间构象也影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA迁移速率是：闭环型线型单链开环型。对于单链RNA或DNA，它在凝胶电泳中的迁移率受碱基组成和序列的影响，同等大小的核酸可能由于空间构象不同而使迁移率不同，故可利用变性凝胶电泳分离纯化单链核酸。,(2)凝胶孔径的大小,琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide Gel，PAG)是核酸凝胶电泳经常使用的支持材料。琼脂糖凝胶的孔径大，分辨率低，但分离范围广，可分离100bp60kb的DNA；PAG的孔径小，分离小片段(5500bp)DNA效果较好，甚至可以分辨相差lbp的DNA片段。实际工作中应根据凝胶浓度与被分离DNA片段的大小，选择适当种类和浓度的凝胶。,(3)电场强度和方向,低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm。随着电场强度的增加，高分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增加，使凝胶的有效分离范围缩小。大分子量真核基因组DNA片段常采用0.51.0V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨率和整齐的带型。,(4)缓冲液,缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。通常用含EDTA的Tris-醋酸(TAE)、Tris-硼酸(TBE)和Tris-磷酸(TPE)三种缓冲体系。传统用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时问电泳时需要在正、负电极贮液槽之间进行缓冲液循环。TBE与TPE有较高的缓冲能力。,缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般在0.020.2之间。在高离子强度下，溶液导电性增高并明显产热，可能导致凝胶熔解及DNA变性。缓冲液的pH直接影响DNA的迁移率，溶液的pH远离样品等电点时，样品荷电量多，泳动较快。核酸电泳缓冲液常采用偏碱性或中性溶液，使核酸带负电荷，向正极泳动。,第五节 核酸的贮存与鉴定,一、核酸的贮存,DNA而言，最好是溶于pH 8的TE缓冲溶液中，于4保存，其中EDTA系用来螯合二价金属离子以抑制DNA酶活性。TE的pH为8是为了减少DNA的脱氨反应，将溶于TE溶液的DNA放在-70的条件下，能保存5年以上。为了长期保存哺乳动物细胞的DNA，可在样品中加入1滴氯仿，以避免细菌和核酸酶的污染。RNA则可溶于1的DEPC处理过的超纯水中，于-80 冰箱保存，也可用乙醇沉淀，于-20长期保存。但应避免对DNA和RNA的反复冻融。,二、核酸的含量测定,核酸的最大吸收波长为260rim，吸收低谷在230nm，利用这一物理特性可通过测定其200300 nm范围内的紫外吸收值对核酸溶液进行定量：在波长260nm紫外光下，lcm光程，A260=1时，相当于双链DNA浓度为50ug/ml，单链DNA或RNA为40ug/ml，单链寡聚核苷酸为20ug/ml。可依此来计算核酸样品的浓度。,分光光度法不但可以确定核酸的浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)来估计核酸的纯度：DNA的比值为1.8，对于RNA而言，比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质时将导致比值降低。,三、核酸的纯度估测,可通过琼脂糖凝胶电泳加溴化乙锭染色的方法来定量。在低浓度琼脂糖凝胶(0.65)中加入约50100ng样品DNA，并排依次加入25200ng未经酶解的DNA标准，高分子量DNA(Mr50kb)应为一条靠近DNA的清晰条带。该条带以下的片状模糊是机械或化学降解，更为靠近凝胶底部的模糊条带则是样品DNA中混杂的RNA。通过肉眼比较样品DNA条带与入DNA标准带的亮度，即可对DNA含量进行粗略估计。若通过图像处理设备和凝胶分析软件则可进行更高精度的分析。,