磷酸丙糖异构酶Triose-phosphateisomeraseTPI试剂盒说明书.docx

磷酸丙糖异构酶(Triosephosphateisomerase,TPl)试剂盒说明书微量法IOoT6S注意X正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。测定意义：植物叶绿体中磷酸丙糖异构醉是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化，磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐步转化为蔗糖。测定原理：磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛与NAD在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH,340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。自备实验用品及仪器：天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。试剂组成和配制：提取液一:液体IoOmLXl瓶，4保存。提取液二：液体IoOmLX1瓶，4保存。试剂一：液体12mLl瓶，4C保存。试剂二：粉剂Xl瓶，-2(C避光保存。临用前加2mL蒸储水充分溶解；用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融。试剂三：粉剂Xl瓶，-20C避光保存。临用前加2mL蒸储水充分溶解；用不完的试剂分装后-20°C保存，禁止反复冻融。试剂四：粉剂Xl瓶，-2Oc避光保存。临用前加2mL蒸饱水充分溶解：用不完的试剂分装后-20保存，禁止反复冻融。酶液提取总TPl酶提取：建议称取约Olg样本，加入ImL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎(冰浴，200W,破碎3s,间歇7s,总时间Imin),然后4*C,800Og离心IOmin,取上清测定。胞浆和叶绿体TPl酶的分离：按照植物组织质量(g)：提取液体积(mL)为L510的比例(建议称取约0lg样本，加入ImL提取液一)，冰浴匀浆后于46,200g离心5min,弃沉淀，取上清在4C,80C)Og离心IOmin,取上清用于测定胞浆TPl酶活性，取沉淀加ImL提取液二，震荡溶解后超声破碎(冰浴，200W,破碎3$,间歇7s,总时间ImirI),然后4C,800Og离心Iomin,取上清测定叶绿体中TPl酶活性。建议测定总TPl酶活性，按照步骤提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的TPI,则按照步骤提取粗酶液。测定操作I1.分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至340nm,蒸馆水调零。2.取微量石英比色皿出6孔板，依次加入120L试剂一，20l试剂二，20HL试剂三，20L试剂四，20L3.粗醉液，充分混匀，记录34Onm处IoS的吸光值Al和3103的吸光值A2,A=A2-A1计算公式：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1)按照样本蛋白浓度计算随活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个随活力单位。TPI(nmol/min/mgprot)=A÷(×d)×V反总÷(V样XCPr)÷T=321.54×ZkA÷Cpr(2)按照样本质量计算酶活单位定义：每克组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个随活力单位。TPI(nmol/min/g鲜重)=A÷(×d)XV反总÷(WV样÷V样总)÷T=321.54AAeWV反总：反应体系总体积，0.2mL；:NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm：d：比色皿光径，1cm：V样：加入样本体积，0.02mL：V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，gb.用96孔板测定的计算公式如下(1)按照样本蛋白浓度计算酶活单位定义：每亳克组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个随活力单位。TPI(nmol/min/mgprot)=A÷(×d)×V反总÷(V样XCPr)÷T=643.08×A÷Cpr(2)按照样本质量计算酶活单位定义：每克组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。TPI(nmol/min/g鲜重)=A÷(×d)XV反总÷(WV样+V样总)÷T=643.08A÷WV反总：反应体系总体积，0.2mL；£：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm：d：比色皿光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL：V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g