层析原理与技术.ppt

层析原理与方法,内容提要,1、层析原理与技术2、层析方法凝胶过滤层析离子交换层析羟基磷灰石层析疏水层析亲和层析,层析的起源和原理,起源-1906年，俄国植物学家Tsweet原理-利用物质分配系数不同达到分离 目的,层析原理,Chromatography,层析,色谱,什么是蛋白层析,根据蛋白分子物理化学特性的不同而达到分离 极性/疏水性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP 离子特性：ionic characteristics(charge)IEX 大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF 结构特征与活性位点：shape(ligand binding,affinity)AC 这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离,层析原理,分离机制,分子的大小-凝胶过滤(size-exclusion)（分子筛，分子 排阻）分子的电性-离子交换（IEC）阳离子交换、阴离子交换分子的表面疏水结构-疏水层析（HIC），反相 其它：羟基磷灰石，金属螯合(IMAC)，亲和，染料配基介质层析精制（polishing）：高分辨率层析,分离机制,层析的基本概念,流动相,固定相,C流出组份123,1,2,3,洗脱峰,层析原理,层析的基本概念,固定相：固定相是层析的一个基质，能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。（在柱层析中称其为层析填料。）它对层析的效果起着关键的作用。,层析原理,流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体等。（柱层析中一般称为洗脱剂。）,A good gel for gel filtration contains about 95%water,层析方法,凝胶过滤层析离子交换层析羟基磷灰石层析疏水层析亲和层析,GelFiltration凝胶过滤,IonExchange离子交换,Hydrophobic Interaction疏水层析,Affinity亲和层析,CHT羟基磷灰石,层析原理,凝胶过滤层析/分子筛,分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。,凝胶过滤,1.Spherical particles packed into a column,2.Sample applied,3.Buffer mobile phase and sample move through column,molecules diffuse in and out of matrix,4.large molecules leave the column first followed by smaller molecules in order of size,molecules larger than the matrix pores pass straight through.,凝胶过滤,凝胶过滤层析,分离纯化原理,Steric exclusion leads to early elution,按照分子量大小洗脱大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱,100 1,000 10,000 100,000 Bio-Gel P2Bio-Gel P4Bio-Gel P6Bio-Gel P10Bio-Gel P30Bio-Gel P60Bio-Gel P100,1,800,800,4,000,1,000,6,000，用于脱盐,1,500,20,000,2,500,40,000,3,000,60,000,5,000,100,000,100,凝胶过滤层析,凝胶的选择,柱长的选择 分离：30120cm 脱盐：30cm以下 洗脱液 离子强度,pH中性流速，根据层析介质的说明，一般很低样品容量：13CV,凝胶过滤层析,操作参数选择,1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质 具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/302.脱盐,凝胶过滤层析,凝胶过滤层析的应用,凝胶过滤层析,凝胶过滤层析的特点：,层析柱规模很大，实验室1.0-2.530-100cm，工艺1020200cm，从而设备成本很高；上样体积少，必须少于柱床体积的3才能达到较好的分离效果，如果大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性；工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上；分辨率低；不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离,因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步，或离子交换上样前的脱盐,离子交换层析,离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。,离子交换层析,离子交换层析,离子交换层析类型及其选择,-O-CH2CH2-NH+,C2H5,C2H5,-N+(CH3)3,-O-CH2-C-O-,O,-SO3-,pI,stability range,stability range,与阳离子交换介质结合,+,-,denaturation,denaturation,pH,10,2,离子交换层析,离子交换层析原理蛋白质滴定曲线,蛋白质净电荷,与阴离子交换介质结合,Products:UNOsphere Q&S,Macro-Prep High Q&S,CM,DEAE,AG resins,Equilibration,SampleApplication,SampleAdsorption,Elution,Regeneration,离子交换层析,离子交换层析原理,sampleapplicationand wash,elution,equilibration,regeneration,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,anionexchangerbead,离子交换过程,离子强度 洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。,缓冲液与pH 选择适当的缓冲体系，起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M)缓冲液PH值：阳离子低于pI一个pH单位以上 阴离子通常高于pI一个pH单位以上 蛋白质在不同pH下保留行为差别较大，所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索，以得到最佳层析条件。,离子交换层析,离子交换层析操作参数选择,pI5.5,+,-,pH,10,2,离子交换层析,缓冲液与pH,pI7.5,阳离子交换,阴离子交换,碱性蛋白，采用阳离子交换,酸性蛋白，采用阴离子交换,蛋白质净电荷,pH4.0,pH9.0,蛋白质稳定性范围,pH 7.0,pH 8.0,pH 8.9,pH 6.0,缓冲液与pH的影响阴离子交换,离子交换层析,离子交换层析操作参数选择,离子交换层析,离子交换层析操作参数选择,盐溶液梯度的影响,疏水层析,基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合不同离子的疏水性Anions:SO42-Cl-Br-NO3-ClO4-I-SCN-Cations:Mg2+Li+Na+K+NH4+蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱,原理,疏水层析,疏水层析,生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合高离子强度可加强疏水性跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又 可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析 步骤的桥梁，取代盐析沉淀技术配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合，可用疏水层析试盒选择介质,作用原理,溶质,曝露在外的疏水基,配基,水分子,大量水分子,DG=DH-T DS,操作参数选择,疏水层析,疏水介质选择：甲基，丁基，苯基疏水 疏水性强的蛋白质：甲基，丁基 疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基盐：硫酸铵，醋酸铵等等缓冲体系和pH洗脱梯度,Sample:GFP sample brought up to 2 M AS,filteredLoad:5 mlBuffer:A:2 M(NH4)2SO4+0.1 M NaP,pH 7B:0.1 M NaP,pH 7Flow Rate:3 ml/min(230 cm/hr),Macro-Prep 甲基疏水,苯基疏水,20%EtOH,疏水层析,亲和层析,亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。,亲和层析,EquilibrationSample applicationBinding and washingDesorption and elution,Equilibrate the column and the sample to binding conditions.,亲和层析,亲和层析,EquilibrationSample applicationBinding and washingDesorption and elution,Apply sample under binding conditions.,亲和层析,EquilibrationSample applicationBinding and washingDesorption and elution,Change the eluent to elute the target.,Profinity IMAC纯化His-tagged ProteinChelex 100纯化DNA，PCR样品制备Affi-Gel Protein A纯化单克隆抗体Dye-Affi-Gel Blue(DEAE or CM)纯化单抗，分离HSAAffi-Gel 肝素凝胶多种蛋白，如凝结因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶Affi-Gel Polymixin去除内毒素（热原）Affi-Gel 硼胶分离核苷酸、核苷、儿茶酚胺、糖类等小分子,亲和层析,产品与应用,Profinity IMAC Resins,固定化金属螯合层析：Immobilized Metal Affinity Chromatography（IMAC）,基于纯化重组组氨酸标记蛋白设计，专门纯化His-tagged Protein 螯合带电离子，如Zn2+,Ni2+,Cu2+,现有的产品为螯合Ni2+的介质,UNOsphere 技术 更好的流动特性，在高流速下载量，目的蛋白得率和纯度不会受到影响。,IDA,不同 IMAC 介质纯化氨基肽酶(aminopeptidase)纯度比较,Profinity IMAC,IDA ligand,Profinity IMAC Resins,Profinity IMAC Resins 纯化 6His-tagged protein,Sample：E.coli.lysate,96%纯度,Profinity IMAC Resins,羟基磷灰石层析,Ca10(PO4)6(OH)25 个带正电荷的Ca离子对（C位点）2 个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点）2 个羟基于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面,CHT陶瓷羟基磷灰石晶体结构,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,蛋白质带正电氨基经典的阳离子交换用中性盐溶液(NaCl)或缓冲盐溶液(PO4)洗脱,初级保留机制,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,带负电羧基经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节比离子间静电相互作用强1560倍在无PO4 条件下不能被任何浓度NaCl洗脱用PO4洗脱,初级保留机制,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,优点独特的分离机制高再生能力 高分辨率容易规模放大容易进行方法开发高机械稳定性高化学稳定性层析柱寿命长,颗粒大小：20um、40um和80um,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,Type I由于具有更高的表面积，I型具有更高的蛋白载量，而且具有更大的保留.Type II由于具有大孔结构，II 型具有更高的核酸载量，能分离单链和双链DNA，和超螺旋与非超螺旋的DNA白蛋白不能与II型结合，对于一些含白蛋白的抗体样品，II型分离纯化更有利.大分子重组疫苗的中间纯化和大规模制备,如何选择类型,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,分离纯化原理与操作参数选择,羟基磷灰石（CHT）,影响蛋白质色谱行为的操作参数：CHT类型 NaCl浓度 PB缓冲液浓度梯度 双梯度洗脱 PB缓冲液梯度含不同NaCl浓度 缓冲液pH值,双梯度洗脱模型先以0-500mM NaCl，再以0-500mM 磷酸钾,双梯度洗脱,羟基磷灰石（CHT）,0-0.5MNaCl,0-0.4MNaPO4,玉米种子中纯化转基因抗体IgG,单克隆抗体，多克隆抗体纯化重组疫苗抗体片段重组蛋白质酶核酸:DNA/RNA(单双链)膜蛋白质,羟基磷灰石应用,陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术,Size Exclusion(SEC)分子筛（或凝胶过滤）分子大小 用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化Ion Exchange(IEX)离子交换电荷 可用于 层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化Hydrophobic Interaction(HIC和RP)疏水疏水相互作用-用于中间纯化，去除脂类和脂多糖Affinity(AC)亲和生物相互作用 用于复杂样品的最早捕获或中间纯化Ceramic Hydroxyapatite(CHT)羟基磷灰石独特分离机理，包含离子交换和金属螯合等,可用于 层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化,层析技术,