大孔吸附树脂吸附分离技术.ppt

中药有效部位分离纯化新技术 大孔吸附树脂吸附分离技术,2011年度医药初级专业技术人员 远程教育,中药有效成分或有效部位的提取分离与纯化，是实现中药现代化的关键技术之一。自20世纪70年代以来，中药的提取纯化工艺及设备基本没有明显的改进和突破，致使我国目前的中药制药技术远远滞后于国际制药工业水平。作为中成药生产过程中最关键的环节，落后的提取纯化工艺已成为影响中成药质量和临床疗效的关键问题，也是制约中药产业化发展和拓展国际市场的主要因素之一。,大孔吸附树脂吸附分离技术是采用大孔吸附树脂，通过物理吸附从中药及其复方提取液中有选择性地吸附其中的有效部分，去除无效部分的一种提取纯化的新工艺，可以达到分离、富集中药有效部位或有效成分的目的。目前，该技术在日本已被广泛应用于“汉方药”的生产中，且日本生产有“药用标准”的、性能良好的树脂产品。,近年来在我国，该技术也逐渐被应用于中药活性部位或活性成分的提取分离、中药新药的开发研制与中成药的生产中。该技术作为我国中药制药工业目前亟须推广的高新技术之一，它的大力推广应用，将有利于解决中药提取分离与纯化中长期以来存在的诸多问题，可大大加快中药产业现代化发展的进程。,一、大孔吸附树脂简介,大孔吸附树脂(Macroporous Adsorption Resin)是20世纪60年代发展起来的、继离子交换树脂之后的一类新型分离材料，是一类没有可解离基团，具有多孔结构，不溶于水的固体高分子物质。它具有选择性好、吸附性强、吸附速度快、机械强度高、再生处理方便等特点。大孔吸附树脂吸附分离技术的核心是吸附树脂的性能及其相关的应用工艺，两者对分离效果均有重要影响。因此使用该技术进行中药成分提取分离的时候，首先应该了解大孔吸附树脂的性能及其使用方法。,1组成与结构 大孔吸附树脂主要以苯乙烯、二乙烯苯等为原料，在0.5的明胶溶液中，加入一定比例的致孔剂聚合而成。其中，苯乙烯为聚合单体，二乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯等作为致孔剂，他们互相交联聚合形成了大孔吸附树脂的多孔骨架结构。此外，大孔吸附树脂的聚合单体还有2甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、丙烯腈、丙烯酸酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、丙烯酸胺、亚砜、氧化氮类等，交联剂有双（甲基丙烯酸）乙二醇酯、甲基丙烯酸等，致孔剂有石蜡、溶剂汽油、煤油、碳醇、聚乙烯醇等。,大孔吸附树脂一般为白色球形颗粒，粒度为2060目。大孔吸附树脂的宏观小球系有许多彼此间存在孔穴的微观小球组成，其结构的主要特点是多孔性。因此，孔径、孔体积及孔的比表面积作为表征其结构的参数，对其吸附性能具有重要影响。大孔吸附树脂孔的形状是不规则的。,为了能相对表征孔的大小，在大孔吸附树脂孔参数的测定与计算中，一般采用圆筒形孔模型，孔的半径（r）与孔体积（V）、比表面积（S）之间有以下关系：r 2 VS 此式可作为孔参数测定与计算的依据。孔径：大孔吸附树脂的孔径大小是不均匀的，表征孔径时常用平均孔径和孔径分布。通常所说的孔径实际上就是指的平均孔径。测定孔径的方法参照文献。,比表面积：大孔吸附树脂单位质量的表面积即为比表面积，一般以m2g表示。大孔吸附树脂的比表面积一般可达5001000m2g，这是其具有良好吸附性能的基础。测定比表面积的方法参照文献。孔容：也称孔体积，系指单位质量大孔吸附树脂孔的总体积，以mlg表示。大孔吸附树脂的孔容一般为0.51.1mlg。若以孔体积占大孔吸附树脂总体积（包括孔体积和树脂的骨架体积）的百分数表示，则称为孔隙率或孔度。,2吸附原理与性能 大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料。它的吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果，分子筛性是由于其本身多孔性结构所决定的。因此，有机化合物根据其分子量的大小及与大孔吸附树脂吸附力的不同，在大孔吸附树脂柱上实现分离。,大孔吸附树脂的性能包括许多方面，如对溶液中的溶质的吸附量、吸附率、吸附速度、吸附选择性、脱附性能等。在实际应用工艺中，对树脂性能的要求往往是全面的，任何一项性能的缺陷都可能成为应用工艺成败的关键。可以通过对比上柱量、比吸附量、比洗脱量、保留率、纯度等树脂吸附特性参数的测定与计算来评价大孔吸附树脂分离纯化的效果、质量与效益。,沉降密度：干树脂重量（W）与水中沉降后的体积（V）的比值。是树脂体积与重量的换算参数，可用于准确评价大孔吸附树脂吸附、洗脱效果。,比上柱量：达吸附终点时，单位质量干树脂吸附夹带成分的总和。用于评价树脂吸附、承载能力。比上柱量越大，承载能力越强，是确定树脂用量的关键参数。计算公式为：S（M上M残）W 其中M上为上柱溶液中指标成分的质量（上柱溶液体积指标成分浓度）；或以上柱溶液相当于药材质量表示，则为上柱溶液体积与单位体积浸出液相当于药材质量的乘积。M残为过柱流出液中指标成分的质量（过柱流出液体积指标成分浓度）。W为干树脂重量。,比吸附量：单位质量干树脂吸附成分的总和。表示树脂的真实吸附能力，比吸附量越大，吸附能力越强，是选择树脂种类、评价树脂再生效果的重要参数。计算公式为：Q（M上M残M水洗）W 其中M上、M残同上，M水洗为上柱结束，最初用水洗脱下来的指标成分的质量（水洗液体积指标成分浓度）。W为干树脂重量。比吸附量的计算也可采用下面的公式：Q（C0Cr）VW 其中C0为指标成分起始浓度，Cr为指标成分剩余浓度，V为溶液体积，W为干树脂重量。,吸附率：用于评价树脂对待分离组分的吸附能力。是选择树脂种类、评价吸附工艺优劣的参数。计算公式为：A（C0Cr）C0100 其中A为吸附率，C0为起始浓度（mgml），Cr为剩余浓度（mgml）。,比洗脱量：吸附饱和后，用一定量溶剂洗脱至终点，单位质量干树脂洗脱成分的质量。用于评价树脂的解吸附能力及洗脱溶剂的洗脱能力。比洗脱量越大，表示树脂的解吸附能力与洗脱溶剂的洗脱能力越强，是选择树脂种类及洗脱溶剂的重要参数。计算公式为：EM洗脱W 其中M洗脱为用洗脱溶剂洗脱出的指标成分的质量（洗脱液体积指标成分浓度）；W为干树脂重量。,保留率：用于评价树脂纯化的效果、范围、质量和效益。计算公式为：RM洗脱M上100 其中M洗脱、M上同上。纯度：用于评价树脂纯化的效果、范围、质量和效益。计算公式为：P=M成分M总团体100 其中M成分同上，M总固体为用洗脱溶剂洗脱出的洗脱物总量。,3类型与规格 大孔吸附树脂按其化学结构，即根据骨架材料是否带功能基团，可分为非极性、中等极性、极性和强极性四种类型。,非极性大孔吸附树脂：一般是指电荷分布均匀，在分子水平上不存在正负电荷相对集中的极性基团的树脂，大部分为苯乙烯、二乙烯苯聚合物。中等极性大孔吸附树脂：此类树脂内存在酯基一类的极性基团，具有一定的极性。常见的是聚丙烯酸酯型聚合物，以多功能团的甲基丙烯酸酯作为交联剂。,极性大孔吸附树脂：此类树脂多具有酰基、亚砜、腈等基团，极性较大。如以丙烯酸胺、亚砜等作为聚合单体的树脂。强极性大孔吸附树脂：此类树脂含有极性很强的极性基团，如吡啶基、氨基等。以氧化氮类作为聚合单体的树脂也属于此类型。目前国内外可用于医药行业的大孔吸附树脂的种类很多，一些常见的大孔吸附树脂的性能指标见表13l、表 132。,表131 国外主要大孔吸附树脂性能表,表132 国内主要大孔吸附树脂性能表,4质量要求和质量评价 大孔吸附树脂的质量对中药纯化效果和安全性起着决定性作用。在使用以前，充分了解各种树脂的结构、组成、性能和适用范围，选择适宜的树脂，并控制严格的质量标准，对提高纯化效果、保证纯化产物的安全有效至关重要。,药用大孔吸附树脂的质量标准应包括名称、牌（型）号、结构（包括聚合单体、交联剂、致孔剂）、外观性状、极性，粒径范围、含水量、湿密度（真密度、视密度）、干密度（表观密度、骨架密度）、比表面积、平均孔径、孔容（孔体积）、孔度（孔隙率）、刚性、溶胀系数（水乙醇）等物理参数，未聚合单体、交联剂、致孔剂等添加剂残留量限度等参数，主要用途、该质量标准的级别、贮藏及相关批准文号等。,药用大孔吸附树脂的使用说明书应包括以下内容：,（1）树脂性能简介。（2）主要添加剂种类与名称。（3）树脂残留物总量限量及检查方法，未聚合单体、交联剂、致孔剂等主要添加剂残留量控制方法及限量检查方法。,（4）树脂安全性动物试验资料，包括树脂及其粉碎物、预处理前后洗脱溶剂浓缩液等的急性毒性试验、长期毒性试验结果，或其他能证明其安全性的试验资料。（5）使用注意事项、可能出现的异常情况的处理方法。（6）树脂的预处理、吸附、洗脱、再生、贮存方法。（7）树脂有效使用期。（8）生产厂家及生产许可证。,目前市售的大孔吸附树脂中大都含有未聚合的单体、交联剂、致孔剂、分散剂及防腐剂等。这些有机物可能会在生产过程中带入药品而影响人体健康。因此根据大孔吸附树脂的结构、组成、性能和适用范围，建立适宜的质量评价标准及方法是十分必要的。质量评价的标准及方法应包括以下两方面的内容。,树脂残留物检查 为保证树脂的安全可靠，应对树脂中未聚合的单体和交联剂、致孔剂、分散剂、防腐剂等各种添加剂的残留物总量进行检查，建立树脂残留物及裂解产物的检测方法，并制订合理的限度。,苯乙烯骨架型大孔吸附树脂多以苯乙烯为聚合单体，二乙烯苯为交联剂，甲苯（工业用规格常含有苯、二甲苯等杂质）、汽油（主要为烷烃类成分）为致孔剂，其残留物检查项目暂定为：苯2mg/g、甲苯890mg/g、二甲苯2170mg/g，苯乙烯、烷烃类、二乙烯苯等的限量不能高于国家标准或国际通用标准，其中烷烃类的检查可将重点放在残留物较高及毒性较大的成分（如正己烷）上。,不同型号的树脂残留物检查种类除规定的种类以外，可根据其在实际生产过程中所用致孔剂及其他化合物的种类而有所差异。非苯乙烯型大孔吸附树脂及特殊型号的苯乙烯型大孔吸附树脂（包括骨架上连有特殊基团以改变极性的，或采用其他有毒性的溶剂为致孔剂，或对树脂进行了后交联反应的等），应对相应的未聚合的单体、交联剂、有毒性的致孔剂及树脂合成过程中使用的有可能带入产品的化合物等进行限量检查，必要时列入质量标准。,另外，需注意供药用的大孔吸附树脂生产过程中所用致孔剂应避免使用一类溶剂，慎用二类溶剂。一类和二类溶剂的具体品种见表133。若因某些原因确实需要使用二类溶剂，应对相应的溶剂进行限量检查，并制订合理的限量标准。树脂残留物的检查方法多采用将树脂研成细粉，溶剂革取，GC、GCMS定性和顶空进样毛细管气相色谱定量方法。,表133 药品中的一、二类溶剂,安全性试验 苯乙烯型大孔吸附树脂稳定性一般较高，目前暂不要求进行动物安全性考察。但须根据树脂残留物可能产生的毒性反应，在做药物成品的毒理学试验时，适当延长观察周期，增加观察项目与指标，如神经系统、骨髓、肝肾功能等生化指标。同时对定型产品抽样进行安全性动物试验，以保证产品的安全性符合药用要求。对非苯乙烯型大孔吸附树脂，因使用时间相对较短，其稳定性亦低于苯乙烯型树脂，一般情况下，应进行动物安全性试验，以证明其安全性。,5预处理 商品大孔吸附树脂在出厂前一般未进行彻底清洗，含有较多的未聚合单体与交联剂、致孔剂、分散剂、防腐剂等各种有机残留物。如果直接使用，会影响药品的质量和安全，因此在使用前必须进行预处理，以去陈树脂所含的杂质，提高树脂洁净度。同时，合理的预处理方法还可使树脂的孔得到最大限度的恢复，提高树脂的吸附性能。树脂预处理的方法可以采用回流提取法、渗漉法或水蒸气蒸馏法，预处理的溶剂可以选择乙醇、丙酮、异丙醇、25盐酸或 25氢氧化钠等。,（1）渗漉法 采用玻璃或不锈钢色谱柱（径高比为1:31:7），湿法装柱。洗脱溶剂为乙醇25盐酸25氢氧化钠水，具体操作为：乙醇浸泡12小时2倍树脂体积（2BV，下同）洗脱浸泡35小时2BV洗脱浸泡35小时35BV洗脱浸泡35小时35BV洗脱23BV盐酸浸泡24小时洗脱水洗脱23BV氢氧化钠浸泡24小时洗脱水洗脱。,在用乙醇浸泡树脂前，也可先用水进行反洗，使树脂层松散、展开，将树脂的微细粉末及一些机械杂质洗去，然后放出水，再加乙醇浸泡。若大孔吸附树脂因长期存放变干，或要求更严格的清洗，可用水乙醇甲苯乙醇水依次洗脱，这样不仅能洗出有机杂质，还可洗出线型聚合物。对于变干缩孔的吸附树脂还能使其孔结构恢复至最佳状态。,（2）回流提取法 大孔吸附树脂加丙酮或甲醇浸泡24小时，加热回流提取（或用改良索氏提取器加热洗脱），视树脂中可溶性杂质的多寡，一般需34天，甚至长达78天。,另外，也有研究尝试采用醋酸纤维素膜截留大孔吸附树脂残留物。l万分子截留量的醋酸纤维素膜对苯乙烯有较好的截留作用，其对水溶液中苯乙烯的清除率为50.5%。,在新药研究开发与药品生产时，应建立大孔吸附树脂预处理的方法及相应的合格标准。适宜的预处理方法应能将树脂残留物控制在安全范围内。目前多以醇洗脱液加数倍量水不显浑浊作为树脂预处理的合格标准，不够全面，应进一步研究，建立更科学合理的标准。对于苯、甲苯、二甲苯等含共轭双键的残留物可用紫外吸收作为指标。,对于不挥发性有机残留物的检查可参照美国联邦条例第170199部分3卷21条“食品和药品：对可用作食品处理的离子交换树脂的规定（1998年修订）”，以洗脱液中有机残留物总量为指标，进行限量检查。方法采用重量法：取50ml树脂装柱，用蒸馏水、95乙醇、5醋酸依次洗脱，控制流速为350400m1/h，弃去1L初洗液，收集2L续洗液，挥干，于105干燥至恒重，测定浸出物质量，然后再于850 灼烧至完全灰化，恒重，测定灰分质量，二者之差即为不挥发性有机物残留量。,利用气相色谱法对树脂残留物进行检查是一种较好的方法，目前应用较多。例：AB8型大孔吸附树脂 树脂预处理方法：乙醇浸泡24小时后的树脂14g装柱（内径14mm，树脂柱长150mm）水120ml洗脱乙醇50ml洗脱5盐酸40ml洗脱水60ml洗至流出液呈中性5氢氧化钠40ml洗脱水80ml洗至流出液呈中性。残留物检测方法：气相色谱法。HP17毛细管色谱柱；载气：氢气，流量6mLmin；汽化温度：170对苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯进行检测。,6再生 大孔吸附树脂使用一定周期后，吸附能力降低，需要强化再生。树脂再生用的溶剂可以选择乙醇（5095）、甲醇（50100）、异丙醇、丙酮（50100）、碱性乙醇溶液、25盐酸和25氢氧化钠，洗脱方法可以选择正洗脱，也可选择逆流洗脱。若树脂污染不严重，一般用95 乙醇洗脱至无色止，树脂即已再生，用大量水洗去乙醇，可用于相同样品的分离纯化。若树脂污染严重，颜色较深，则需用酸碱强化再生。具体方法为用35盐酸浸泡树脂24小时34BV 35盐酸洗脱水洗脱至流出液呈中性35氢氧化钠浸泡树脂24小时34BV 35氢氧化钠洗脱水洗脱至流出液呈中性。,树脂经多次使用，柱上方沉积有悬浮不溶物，或柱床挤压过紧，或树脂颗粒破碎，都会影响流速，此时可选择逆流洗脱方法，用水或醇从柱下进行反洗，以便使柱床变松，悬浮不溶物或树脂破碎颗粒从柱上方被顶出。也可自柱中取出树脂，用水漂洗，除去悬浮不溶物或树脂破碎颗粒，再重新装柱使用。,由于树脂再生后的性能会影响到下一轮的纯化分离，故在新药研究开发与药品生产时，需建立评价树脂再生是否合格的指标与方法，以证明树脂经多次反复再生后其纯化效果保持一致。树脂再生合格的检测指标可以选择比吸附量、洗脱量或吸附容量。原则上，对纯化同一品种的树脂，当其吸附容量下降30以上时，则应视为不宜再使用。,树脂再生次数（即树脂使用寿命）与树脂的组成、结构以及纯化对象和工艺条件有关。一般而言，树脂的稳定性顺序为非极性中等极性极性强极性。树脂经几百次的吸附与解吸附，有裂解的可能性，尤其在碱性条件下或与氧化剂作用，稳定性会明显下降，裂解为苯乙酮或苯二乙酮类。因此需要通过实践，制订合理的树脂再生次数或树脂使用期限。,7 保存 大孔吸附树脂应湿态保存，不宜干燥，原因是易引起缩孔，使树脂吸附性能下降。如果树脂暴露在空气中失水，可用乙醇或丙酮浸渍，使其充分溶胀后使用。大孔吸附树脂应在0以上保存，因商品树脂含水量约在70左右，温度低于0，会使球体胀裂，破坏强度。,二、大孔吸附树脂吸附分离技术基本操作程序 运用大孔吸附树脂吸附分离技术分离纯化中药有效成分或有效部位时，首先应根据待分离组分或部位的理化性质，筛选出适宜的树脂。在此基础上，按下面的基本操作程序进行：树脂预处理树脂吸附树脂解吸附（树脂洗脱）树脂再生。前面已经讨论了树脂预处理与再生的有关问题，此处重点介绍树脂筛选、吸附和解吸附。树脂选择是否合适，树脂吸附和解吸附工艺是否合理，是大孔吸附树脂吸附分离技术的核心问题，对中药有效成分或有效部位的纯化分离效果影响很大。,1树脂筛选 针对具体的分离纯化目的，首先需要选择适宜的大孔吸附树脂，以保证大孔吸附树脂对待分离组分的高选择性和高吸附性，从而满足分离纯化的要求，提高分离纯化的效率。大孔吸附树脂对物质的分离纯化取决于它的吸附性和分子筛性。吸附性的大小又取决于树脂的极性和被分离组分的极性，分子筛性则取决于树脂本身的多孔性结构和待分离组分的分子大小。因此，树脂本身的极性大小与孔结构对待分离组分的选择性吸附是非常重要的。,吸附性：大孔吸附树脂对物质的吸附遵从类似物吸附类似物的原则，即极性大的树脂对极性大的组分吸附性强，对极性小的组分吸附力弱，反之亦然。因此，应根据待分离组分的极性大小选择相应极性的树脂。一般而言，极性较大的组分适于在中极性的树脂上分离，极性小的组分适于在非极性树脂上分离。吸附性的大小可通过测定吸附量来评价，吸附量大则意味着吸附性强。10种不同类型的大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附量见表134。,表134 10种大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附量（20，mg/g）,由表134可见，极性的 S-8 树脂与弱极性的 AB-8 树脂对银杏叶黄酮吸附量大，而非极性的 H107 树脂吸附量小。这是由于银杏叶黄酮具有多酚结构和糖甙链，具有一定的极性和亲水性，生成氢键的能力较强，有利于弱极性和极性树脂的吸附。对于非极性树脂，即使有较大孔径（如X5），对黄酮的吸附量也偏小。,分子筛性：有机物通过树脂的网孔扩散到树脂网孔内表面而被吸附，树脂孔径大小直接影响不同大小分子的自由出入，从而使树脂吸附具有一定的选择性。树脂吸附能力大小与树脂孔径大小、组分分子大小密切相关。分子较大的组分宜选择较大孔径的树脂，否则将直接影响到分离效果。例如，银杏总黄酮的平均分子量为760，其分子体积较大，使用孔径较大的树脂S8（孔径为28.030.0nm）进行吸附，吸附量为126.7mgg，而使用孔径较小的树脂D4006（孔径为6.57.5nm）时，吸附量仅为19.0mgg。,在树脂孔径适合条件下，树脂的吸附量随比表面积的增大而增大，如NKA9树脂孔径为15.516.5nm，虽然与AB8树脂接近，但由于比表面积显著小于AB8树脂（NKA9树脂的比表面积为250290m2g，AB8树脂的比表面积为480520 m2g），其吸附量显著小于AB8树脂。孔容的大小直接影响树脂的体积比表面积（每 l ml湿树脂所具有的表面积），在实际应用中，体积比表面积对吸附量起着重要作用，树脂孔体积增大会引起体积比表面积下降，反而使吸附量降低。,大孔吸附树脂的性能包括许多方面。在实际应用工艺中，对树脂性能的要求往往是全面的，任何一项性能的缺陷都可能成为应用工艺成败的关键。因此在选择树脂时，必须综合考虑树脂的极性、孔径、比表面积、孔容等性能参数，以及对待分离组分或部位的吸附量、吸附率、吸附速度、吸附选择性和解吸率等。实际应用时，可以通过对树脂比上柱量、比吸附量、比洗脱量、保留率、纯度等反映树脂吸附特性的参数测定与综合评价，来选择适当的大孔吸附树脂用于组分或部位的分离纯化。,2树脂吸附2.1 吸附方式 大孔吸附树脂的吸附方式可分为静态吸附与动态吸附两种。静态吸附可在带搅拌的釜和槽中进行。溶液黏度较大，悬浮物较多时可用此法。如果加入吸附树脂后不进行搅拌，吸附树脂的吸附速度较慢，为了提高吸附速度，进行适当的搅拌是必要的（这仍然称为静态吸附）。,动态吸附多在不锈钢或搪瓷柱中进行，柱下部或上、下部装有80目的滤网。实验室则常用玻璃柱。将树脂装在层析柱中，是固定的，药液是流动的，因而被称为动态吸附。在动态吸附中，树脂床因装填的不均匀性、气泡、壁效应或沟流的存在，吸附饱和层面的下移常是不整齐的，即存在所谓“偏流”现象。并且当吸附过程临近结束，部分组分从柱子漏出时，柱子底部的树脂层尚未达到吸附平衡，因此动态吸附时，树脂的吸附容量可能会有些变化。,2.2 吸附动力学和吸附速率 在有充分时间进行吸附的情况下，不同型号的大孔吸附树脂可能具有相近的饱和吸附量，但是由于各树脂化学和物理结构的差别，其吸附动力学过程是有差异的。如根据不同大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附动力学过程，可将树脂分为三类。第一类为慢速吸附树脂，如H107、SIP1300，起始阶段吸附量较小，达到平衡时间长，饱和吸附量不大；第二类为中速吸附树脂，如S8、AB8、RA、SIP1400、X5，起始阶段吸附量较大，然后吸附量逐渐增加，达到平衡时间较长；第三类为快速吸附树脂，如NKA9、D3520、D4006，起始阶段吸附量有大有小，但均迅速达到平衡。,大孔吸附树脂的吸附速度与粒径、孔隙率有关。Langmuir提出的吸附速率方程可初步用于各树脂的比较分析：Ln Qe(QeQt）Kt或-ln(1一QtQe）Kt 式中,Qt为t时刻树脂的吸附量；Qe为平衡时刻树脂的吸附量；K为吸附平衡速率常数。对于各种型号的树脂，用其In（1-QtQe）对时间t作直线回归，即可求得各自的吸附平衡速率常数K。,23 吸附树脂柱 大孔吸附树脂柱一般采用蒸馏水湿法装柱，在上样以前，需要用水反复冲洗平衡，使树脂床沉降均匀，没有气泡。否则会因为壁效应或沟流存在，在上样时产生“偏流”现象，导致泄露点提前，吸附容量降低。,树脂柱径高比（树脂柱内径与树脂床高度的比值）对树脂的吸附性能也有影响，合适的径高比可为分离提供较高的柱效，从而更有利于树脂的吸附与分离。树脂柱径高比一般可控制在1：37。另外，在选择树脂柱径高比时，还需要考虑树脂的强度和溶胀系数。树脂的孔隙率越高，孔体积越大，则强度越差，溶胀系数越大，树脂床的高度就不宜过大。,24 待吸附样品 待吸附样品一般需配置成一定浓度的水溶液上样。为避免树脂柱被污染堵塞，水溶液上样前一般需经过滤，除去较多的悬浮颗粒杂质。若样品量少，在水中不能全部溶解，也可以将样品先溶于少量乙醇或甲醇中，拌入适量树脂，挥去乙醇或甲醇后，再将拌有样品的树脂加到树脂柱上。,中药水提液是一种十分复杂的混合体系，其中存在大量的鞣质、蛋白质、多糖等大分子物质及许多微粒、亚微粒以及絮状物等，易引起大孔吸附树脂的毒化，导致吸附能力下降。上样以前，采用适当的方法对样品溶液进行预处理，不仅能够保护树脂吸附性能，提高解吸物的纯度，而且能够减轻树脂污染，延长使用寿命。,样品溶液预处理的方法通常采用醇沉或高速离心。但需要注意的是，醇沉法易引起有效成分的损失，高速离心法效果较差，近来有研究采用陶瓷膜微滤技术对样品溶液进行预处理，效果较为理想。苦参水提液采用高速离心法和陶瓷膜微滤法分别预处理后用AB8树脂进行吸附，吸附饱和时苦参总黄酮的比吸附量分别为3.96和3.99mgml，高于未经预处理的苦参水提液。用D140、A404树脂吸附银杏叶黄酮，样品预处理方法对其在树脂上的吸附、解吸附性能有显著影响。样品经脱蜡预处理后，洗脱物的纯度大大提高，得率增加（表135）。,表135样品预处理方法对银杏叶黄酮解吸附的影响,样品溶液的浓度、pH值、离子强度、温度等对大孔吸附树脂的吸附性能均有不同程度的影响，需针对不同样品，通过试验研究，选择合适的条件。,24浓度 在一定浓度范围内，大孔吸附树脂的吸附量随样品溶液浓度的增加而增大。但样品溶液浓度的增加有一定的限度，因为随着浓度的增大，样品组分的分配系数（在达到吸附平衡时，组分在吸附树脂中的浓度与在溶液中的浓度之比）会减小。,需要注意的是，在中药有效成分或有效部位的分离纯化中，随着样品溶液浓度的增加，树脂的泄露点会明显提前，导致计算出的树脂比吸附量降低。这可能与中药成分复杂、浓度增大后溶解性不好以及样品组分的分配系数减小有关。有鉴于此，分离纯化中药样品时，以较低浓度进行吸附较为有利，如果样品溶液浓度偏高，则吸附量会显著减小。但对一定量的样品而言，样品溶液浓度过低，又会导致样品溶液体积增大，上柱吸附时间增加。因此，适当的样品溶液浓度对提高树脂吸附量，控制吸附时间非常重要，必须通过试验研究加以确定。用NKA9树脂对绿茶浸提液中的茶多酚进行吸附分离时，随上样溶液中茶多酚浓度的增加，树脂的泄露点提前，吸附量逐渐降低。实验结果见表136。,表136茶多酚浓度对NKA9吸附性能的影响,用AB8树脂吸附银杏内酯和白果内酯时，样品溶液内酯总浓度对树脂吸附率和吸附量的影响表现为，AB8树脂对内酯的吸附率先随浓度的增加而增加，达到一定值后再随浓度增加而减小，而吸附量则随浓度的增大而增大，达到一定值后基本不再变化。浓度为4mgml时吸附率最大，但是吸附量未达最大；当浓度为6mgml时吸附量基本已达最大值，但吸附率又有所下降。从吸附率和吸附量二者的角度综合考虑，浓度太大或太小都不好。选择浓度在46mgml之间时，吸附率和吸附量均较高。,242 pH值 pH值对酸性或碱性成分在大孔吸附树脂上的吸附有显著影响。因为pH值的改变，直接影响了酸性或碱性成分在溶液中的解离程度及存在状态，亦即影响了它们与树脂的亲和力。,一般来讲，酸性化合物在酸性溶液中进行吸附，碱性化合物在碱性溶液中进行吸附较为合适，中性化合物可在近中性的情况下被吸附。用D型树脂对汉防已碱等生物碱的酸水溶液进行吸附，其吸附作用很弱。将黄芩素、金丝桃苷、葛根总黄酮的碱性水溶液在D型树脂上进行吸附试验，亦有相同现象，吸附力弱。而在中性及酸性条件下，树脂对它们的吸附力增大。,不同pH值条件下，D151、XAD4和XAD7三种树脂对麻黄碱的吸附量表现为，树脂的吸附量随着pH的增加而逐渐增大，在pH为11.0时均达到最大值。其中XAD4和XAD7在pH5.0、7.0时吸附量极低，这是由于麻黄碱在此pH值下已经质子化，形成了极易溶于水的盐类，而不带功能基团的树脂对于盐类的吸附力很低。而D151在pH5.0时仍具有一定的吸附容量，在于其结构上带有-COOH，此时的树脂发挥了一定的离子交换作用，产生了一定的吸附量。用D140树脂吸附银杏叶黄酮，随pH值的增大，树脂对银杏叶黄酮的吸附量增加，到pH4以后吸附量则随pH值的增大而减小（表137）。,表137pH值对银杏叶黄酮吸附性的影响,243 离子强度 对大孔吸附树脂而言，样品组分在溶剂中的溶解度大，则在该溶剂中，树脂对该物质的吸附力就小，反之亦然。因此样品溶液的离子强度对树脂的吸附性能影响明显。如果在样品溶液中加入适量无机盐（如氯化钠、硫酸钠、硫酸铵等），提高其离子强度，降低样品组分在溶液中的溶解度，就能够使树脂的吸附量增大。同时离子强度的增加，还能加快树脂对样品组分的吸附速度。,用D101和LD601树脂吸附人参总皂音时，在提取液中加入35的无机盐，不仅能加快树脂对人参皂苷的吸附速度，而且吸附容量明显增大。这是由于加入无机盐，降低了人参皂苷在水中的溶解度，使人参皂苷更易被树脂吸附。,244温度 对于一定的吸附体系，温度过低，吸附过程往往在短时间内达不到平衡，升高温度有利于吸附量的提高。但同时吸附反应又是一个放热反应，温度过高，解吸速率加大，反而不利于吸附。实验证明，在室温范围内（2040），温度对树脂的吸附量影响较小，但温度超过50时，比吸附量会明显下降。用LD605树脂吸附黄连生物碱的研究表明，树脂在50时的比吸附量仅为20的70左右。,25吸附流速 对同一浓度的样品溶液，吸附流速过大，树脂的泄露点就会提前，导致吸附量下降、吸附率降低。利用 AB8树脂对葛根素进行动态吸附试验，考察吸附流速的影响，绘制在一定温度、不同流速下的吸附泄露曲线。结果表明，当吸附流速增大时，树脂柱的泄露点前移，且泄露曲线的波幅减小。对同一浓度的银杏叶黄酮溶液，用D140树脂进行吸附，吸附流速为 1、2、3BVh时，其吸附率分别为 56.14、53.79和 51.97。用NKA9树脂吸附茶多酚时，随着吸附流速的加快，树脂的泄露点提前，吸附量下降（表138）,表138吸附流速对NKA9树脂泄露点和吸附量的影响,但吸附流速过小，吸附时间就会增加，在实际应用时，应综合考虑来确定最佳吸附流速，既要使树脂的吸附效果好，又要保证较高的工作效率。,26吸附泄露点和泄露曲线 每种大孔吸附树脂都有一定的吸附容量。当吸附量达到饱和时，树脂对组分的吸附减弱甚至消失，此时组分就会泄露，据此就能得到树脂的吸附泄露点，计算树脂的吸附量，为评价树脂吸附性能、预算树脂用量与可上柱样品量提供依据。吸附泄露点通常需要通过考察树脂的泄露曲线来确定。,3树脂解吸附（树脂洗脱）31洗脱溶剂 洗脱溶剂的选择应符合两种要求：一是洗脱溶剂应能使大孔网状吸附剂溶胀，这样可减弱组分与吸附剂之间的吸附力；一是洗脱溶剂对组分溶解性良好。因为解吸时不仅需要克服吸附力，而且当溶剂分子扩散到吸附中心后，应能使组分很快溶解。,对于非极性大孔吸附树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强；对于中极性和极性树脂，则用极性较大的洗脱剂为宜。实际应用时，应根据大孔吸附树脂对组分吸附力的强弱选用相应的洗脱剂及其浓度。常见的洗脱剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，其中乙醇应用最多。乙醇溶液的解吸附能力随乙醇浓度增加而加强。,树脂解吸附前，通常先用水洗脱，以除去残留在树脂床中未被树脂吸附的杂质，然后以不同浓度的乙醇溶液洗脱，同时配合适当的理化反应或色谱方法（TLC或HPLC）监测洗脱的情况。为了达到满意的洗脱效果，可选择几种不同浓度的洗脱剂来进行洗脱，通过比较，以确定最佳的洗脱剂浓度。,用大孔吸附树脂纯化分离赤芍总苷时，使用不同浓度乙醇进行梯度洗脱，结合HPLC检测，发现 10、20乙醇洗脱液中均含有芍药苷，而30以上浓度的乙醇洗脱液中未检出，故大孔吸附树脂柱用20乙醇洗脱，即可将芍药苷全部洗脱下来。,从管花肉苁蓉中用D101大孔吸附树脂纯化分离松果菊苷时，先用5甲醇水溶液洗脱，除去一部分大极性的杂质，然后再用10 20甲醇水溶液洗脱，得到纯度较高的松果菊苷。,用大孔吸附树脂纯化川芎提取物时，30乙醇即可把川穹提取物中主成分阿魏酸和川芎嗪全部洗脱下来。用DA201树脂分离悬钩子皂苷R1时，依次用水、10、20、30、40乙醇洗脱，收集40乙醇洗脱液即可得到悬钩子皂苷R1。用ZTCl树脂吸附桔梗提取液后，选择 30乙醇洗脱可得到桔梗总皂苷。,用NKA9树脂吸附茶多酚后，选择不同的溶剂进行解吸附，解吸率见表139。茶多酚易溶于含水乙醇、含水丙酮，在水中溶解性稍差。解吸附时，含水乙醇和含水丙酮的解吸率远高于水。因此通常应选择最能溶解吸附质的溶剂为解吸剂。,表139不同溶剂对茶多酚的解吸附性能,另外，洗脱溶剂的pH值和离子强度对树脂解吸附也有一定的影响，在特定情况下，也可能会有显著影响。改变洗脱溶剂的pH值和离子强度，不仅能够提高解吸速度和解吸率，而且能够改变树脂解吸附的选择性。,pH值：对于酸性或碱性吸附物，改变pH值，洗脱溶剂的洗脱能力会有显著变化。如果改变洗脱剂的pH值，使酸性或碱性吸附物形成较强的离子化合物，就很容易被洗脱下来，从而提高解吸率。因此对弱酸性组分可用碱性溶剂洗脱，对弱碱性组分则宜在酸性溶剂中解吸附。例如，黄连生物碱被树脂吸附后，若用50、70、100甲醇洗脱，小檗碱的回收率低，为74.383.46，若用含0.5H2SO4的50甲醇洗脱，则小檗碱的回收率可达 100.03。苦豆子生物碱用 DF01树脂吸附后，用不同 pH值的 80乙醇液解吸附，其解吸率与 pH值的关系见表 1310。显然，pH值愈低，解吸率愈高。,表1310pH值对苦豆子生物碱解吸附性能的影响,离子强度：洗脱溶剂随着离子强度的增加，洗脱能力增强。因此在洗脱溶剂中加入适量的无机盐，就能够提高组分的解吸率。如果吸附发生在高浓度的盐类溶液中，则常常仅用水洗脱就能实现树脂的解吸附。用D101和LD601树脂吸附人参皂苷后，进行解吸附时，在洗脱剂中加入4氯化钠、硫酸钠或硫酸铵，人参皂苷的提取率明显提高，而对纯度几无影响。结果见表1311。,表1311无机盐对人参皂昔解吸附性能的影响（%）,32洗脱曲线和洗脱体积 洗脱曲线作为树脂解吸附工艺筛选中一个非常重要的内容，可用于洗脱溶剂的选择、树脂解吸附状况的监测与评价以及洗脱体积的确定等。,用D101大孔吸附树脂吸附毛冬青总皂苷后，采用不同浓度乙醇进行梯度洗脱，洗脱曲线显示，毛冬青总皂苷主要集中在30和 50乙醇洗脱液中，占全部醇洗脱液中毛冬青总皂苷的885。但由于30乙醇洗脱物总皂苷纯度比50乙醇低，洗脱速度比50慢。最终确定洗脱条件为先用蒸馏水洗去水溶性杂质，再用50乙醇洗脱毛冬青总皂苷。,根据洗脱曲线确定了洗脱溶剂后，需要进一步通过试验确定洗脱体积。方法为树脂柱先用蒸馏水洗去杂质，用量分别选择200ml、150ml和100ml，然后用洗脱剂（50乙醇）200ml洗脱，分段收集，测定洗脱量、洗脱率和总皂苷含量。根据测定结果（表1312）确定蒸馏水用量为100ml，50乙醇用量为 100ml。,表1312毛冬青总皂着洗脱体积确定,为前 100ml50乙醇洗脱物之总量；为前 100ml50乙醇洗脱物之平均含量,33 洗脱流速 洗脱流速的变化会影响树脂的洗脱曲线和洗脱体积。洗脱流速一般控制在0.55m1min为宜。流速过小，解吸附速度太慢，耗用时间较多；流速过大，消耗溶剂增多，成本上升。用AB8树脂吸附喜树碱后，用pH=3的解吸剂在不同流速下进行解吸，结果见表1313。由表可知，解吸流速越快，解吸率越低，当流速为2BVh时，解吸效果最好且节省解吸时间。,表1313洗脱流速对喜树碱解吸率的影响,34 洗脱温度 若温度升高，树脂的吸附力显著降低，也可考虑采用改变洗脱温度的办法实现树脂的解吸附。如牛磺酸在S8树脂上的吸附能力随温度升高而降低，在80时几乎不再吸附，由此可利用变温方法解吸附。即在室温下完成吸附后，再用80的水对吸附在树脂上的牛磺酸进行解吸，解吸率可达 90以上。,4树脂重复使用次数 大孔吸附树脂的一大优点就是可再生供重复使用。但随着树脂使用和再生次数的增加，其吸附性能总会表现出逐渐下降的趋势，进而影响到后面的纯化分离。如用DM130树脂吸附银杏叶黄酮，随着树脂使用次数的增加，银杏叶黄酮吸附率逐渐下降（表1314），在连续使用3次后吸附率下降尤为明显。因此通过试验确定树脂可重复使用的次数，是大孔吸附树脂吸附分离工艺考察中一个不可缺少的内容。原则上，对纯化同一品种的树脂，当其吸附容量下降30以上时，则应视为不宜再使用。,表1314DM130树脂使用次数对银杏叶黄酮吸附率的影响,