单克隆抗体技术讲解.ppt

第四章 抗体工程制药 第三节 单克隆抗体的制备,掌握：单克隆抗体的概念和特点、制备原理，制备方法及基本过程熟悉：单克隆抗体技术的应用了解：单克隆抗体的发展,主要内容,银屑病,手口足病,癌症,亚急性湿疹,没有单克隆抗体前人类所遇见的问题,用于诊断鉴定人的血型类别,用于寻常型银屑病亚急性湿疹,用于复发或耐药的滤泡性中央型淋巴瘤,犬瘟热病毒单克隆抗体,单克隆抗体药物,Georges J.F.Kohler,Cesar Milstein,1975年将产生抗体的淋巴细胞与肿瘤细胞融合,成功建立了单克隆抗体技术。,1984年获得诺贝尔医学和生理学奖。,一、单克隆抗体技术发展,1.概念（1）抗体：是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。,（2）单克隆抗体（monoclonal antibody）：(简称单抗)，由经过特定的抗原处理过的效应B细胞和骨髓瘤细胞杂交得到的杂交瘤细胞产生的具有特异性识别某抗原上的某一个特定抗原决定簇的抗体。,二、单克隆抗体的概念及特点,2.单克隆抗体的特点优点：（1）理化性状高度均一、结构、氨基酸顺序、特异性等 一致（2）生物活性单一、灵敏度高（3）与抗原结合的特异性强，适用于以标记抗体为特点 的免疫学分析方法（4）便于人为处理和质量控制，来源容易，可以在体外“永久”地存活并传代（5）可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗,局限性：（1）固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围（2）反应强度不如多克隆抗体（3）制备技术复杂、费时费工、价格较高,三、单克隆抗体技术的应用,1.检验医学诊断（1）病原微生物抗原抗体的检测：乙肝表面抗原试纸（2）肿瘤抗原的检测（3）免疫细胞及其亚群的检测（4）激素测定：早孕检测试纸、女性排卵检测试纸（5）细胞因子的测定（6）其他：吗啡类毒品检测试纸等2.蛋白质的提纯3.肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术,克隆化过程,四、单克隆抗体制备过程,1.致敏淋巴细胞的准备动物选择：品系、年龄、性别、健康状态抗原接种：方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定收集时间：末次接种后72 h2.骨髓瘤细胞的准备细胞株处于良好的生长状态细胞株保持HGPRT缺陷状态HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,离心 1000rpm 10 min,50%PEG 1 mL,培养液 10 mL,离心 1000rpm 7min,37 C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min,加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内,3.细胞融合,4.HAT选择性培养 HAT是用于筛选具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或胸苷激酶(TK)活性缺陷细胞的培养基。含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸。在氨基蝶呤(二氢叶酸类似物)存在下，这种酶缺陷的细胞不能通过核苷酸合成旁路合成次黄嘌呤和胸苷。HPRT和TK缺陷细胞可以在此培养基中生存。是常用的骨髓杂交瘤细胞选择性培养基。,5.抗体分泌细胞的筛选对筛选方法的要求：多大量样品一次检测；快迅速取得检测结果；准检测结果可靠性高；灵检测方法灵敏度高。常用筛选方法：ELISA、IFA等,6.克隆化过程方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞,B淋巴细胞,注射特定抗原蛋白,骨髓瘤细胞,培养骨髓瘤细胞,融合,多种杂交细胞,专一抗体检验阳性,克隆上述杂交细胞,分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞,单克隆抗体,注射到小鼠体内,体外培养,7.单克隆抗体的制取,体内腹腔接种,体外培养罐法,思考：,1、如何大量生产单克隆抗体？,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,谢谢 祝：同学们学习进步,