单倍体细胞培养.ppt

单倍体细胞培养,BY 吕菲,一、引言,二、单倍体如何产生,五、单细胞培养,三、单倍体植株的鉴定和二倍化方法,四、单倍体植物的用途（育种）,单倍体（Haploid）：指具有配子体（gametophyte）染色体数的孢子体(植物个体)(sporophyte)。单倍体=一倍体？,一、引言,根据物种倍性不同，单倍体可以分为两大类：一类是一倍单倍体,即二倍体物种产生的单倍体；另一类是多倍单倍体,即起源于多倍体物种（如4x、6x）。二倍体(diploid)植物其单倍体（haploid）即一倍体（monoploid）如，玉米 2n=2x=20 n=x=10；水稻 2n=2x=24 n=x=12四倍体(tetraploid)植物其haploid为dihaploid 如，马铃薯 2n=4x=48，n=2x=24六倍体(hexaploid)植物其haploid为triploid 如，普通小麦2n=6x=42，n=3x=21八倍体(octoploid)植物其haploid为tetraploid 如，草莓 2n=8x=56，n=4x=28,单倍体植株特点：,单倍体含有本物种配子染色体数及其全套染色体组，也就是有生活必需的全套基因，因此在适宜条件下，能正常生长。但因为所含染色体仅是正常体细胞的一半，一般表现为：一般比较矮小纤弱，各器官明显减小；雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代；染色体一经加倍，即得到纯合的正常植物体。,体内发生,离体诱导,二、单倍体植株如何产生,体内发生：体内发生 即从胚囊内产生单倍体。这包括：雌核发育：精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传控制下进行雄核发育：卵子与正常的精子受精，进入卵子内的精子染色体加倍，发育为完全为父本性状的二倍体,（1）人工诱导雌核发育的方法,精子遗传物质的失活（假受精）辐射处理：射线（通常用60Co或173Cs)，X射线和紫外线化学处理：甲苯胺蓝、乙烯尿素和二甲基硫酸等显微手术法：直接除去受精卵中的雄原核。细胞分裂的阻止（抑制第二极体排出，发育成二倍体）温度休克法：冷休克、热休克流体静水压作用：化学制剂处理：细胞松驰素B、聚乙二醇,（2）人工诱导雄核发育的方法,辐射处理：射线（通常用60Co或173Cs)，X射线和紫外线 用紫外线、X射线或射线处理卵子，使其遗传物质失活，与正常精子受精，再在适当时间以冷、热或高压等处理。,离体诱导：植物细胞具有潜在的再生性和全能性,能发育为完整植株，故应用组织培养技术对特定组织进行离体培养，可诱导产生单倍体。方法如下：A、花药和花粉培养 B、未受精子房及卵细胞培养,1、概述概念 花药培养:把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株的过程.花粉培养(小孢子培养):从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.,A：花药和花粉培养,花药培养和花粉培养是获是植物单倍体的有效方法之一,2、花药或花粉培养在作物育种中的作用：,（1）缩短育种年限：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需1-2年。,花药和花粉培养,二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。,（2）提高了目标基因型的选择效率,ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb,花药和花粉培养,二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。,花药和花粉培养,植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。利于筛选隐性突变体 提高诱变效率。,（3）诱变育种中的作用,（4）利于获得优良植株 如：芦笋全雄系的培育,（5）用作基础研究的各个领域,花药和花粉培养,2N,N,减数分裂,花药和花粉培养,3、花药和花粉培养中雄核发育的途径,A途径 小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体（2）A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体（3）A-VG途径（E途径）由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体（4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株,花药和花粉培养,B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株。,花药和花粉培养,4、花药培养与花粉培养的异同点,培养目的相同，均获得小孢子植株。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高。,花药和花粉培养,花药和花粉培养,花药培养,被子植物的花药中，细胞按染色体的倍性可分为两类：一类为单倍体细胞，即由花粉中的花粉母细胞减数分裂后形成的小孢子；另一类为二倍体细胞，如药隔、药壁及花丝等组织。,1、研究历史：首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari(1964,1966)。花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。我国花药培养工作虽然开始较晚，但在短短的时间内取得了可喜的进展，1974年中国农科院植物研究所和中国农业科学院烟草研究所，仅仅用了三年的时间，就培养出世界上第一个作物新品种-单育1号烟草品种。,花药培养,2、花药培养的基本程序：,花药培养,挑选适宜的基因型作材料；确定花粉发育时期；材料的预处理；诱导培养；分化培养；染色体数观察和染色体数加倍；花粉植株当代及后代观察鉴定。影响花药培养的因素很多，如材料生理状况和基因型、接种时期、接种方式(如直插、或平放)、培养方式(固体、漂浮、液体浅层连续培养、条件培养等)、基本培养基种类、激素、密度效应与条件培养等。,选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。,花药培养,花药预处理 大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。,花药培养,花药培养常用的基本培养基：N6：高硝态氮，低铵态氮，广泛用于禾本科植物的花药培养 B5、MS、White、Nitch 等。C17（王培等，1986）：适于小麦花药培养，提高 出愈率。,激素：相对较低的激素水平蔗糖：一般2-3%，高浓度对禾谷类较有利,番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应蔗糖浓度 2 3 4 6 10 13 17诱导频率 5 10 12 18 25 45 8,培养条件温度和光照：,花药培养的意义 1.同常规的育种方法相比，利用花药培养可以大大缩短育种年限。2.利用花药培养的单倍体育种较常规育种便于根据表现型进行选择。3.单倍体加倍的纯度，较常规的自交选育出来的自交系纯度要高的多。4.对于自交不亲和的物种可以获得杂交种子。5.在远源杂交方面具有较大的利用价值。,花药培养,花粉培养,花粉培养：把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术 由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。且不受花药的药隔，药壁、花丝等体细胞的干扰。但缺点是比花粉培养难度大。,1、取材时期：四分体时期到单核早期。2、花粉的分离：3、小孢子纯化：对获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子4、花粉的培养,花粉培养,花粉培养技术,材料的准备：1）自然散落法(漂浮培养自然释放法)：将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2）机械游离法 a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。,花粉培养,花粉培养方法,1、平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养：花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活花药的浸提液），凝固后，在表面加入少量液体培养基培养。4、看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养。,看护培养图解,1、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。,花粉植株的形态发生方式,烟草花药培养通过胚状体途径再生形成小植株,花粉培养,1、胚状体发育途径：小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2、愈伤组织发育途径：小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。,四、花粉植株的形态发生方式,花粉培养,愈伤组织转接种到再生培养基,愈伤组织分化形成再生植株,部分花药产生愈伤组织,接种在平板上的水稻花药,水稻花药培养的愈伤化发生途径,花粉单倍体植物的培养程序及其技术关键,花药和花粉培养中的白化苗,影响白化苗形成的因素,花粉发育时期：花药培养中，白花苗的比例随接种时花粉发育时期的延迟而提高。培养基成分：高浓度的2,4-D会使花粉愈伤组织分化出更多的白化苗培养温度：当培养温度提高时，白花苗的数目也随之增加。,花药和花粉培养,1、花粉单倍体植株鉴定的理由1)体细胞干扰2)生殖细胞的自发加倍,三、单倍体植株的鉴定和二倍化方法,2、花粉植株的鉴定方法1)形态鉴定2)细胞学鉴定3)杂交法鉴定4)分子标记鉴定,花粉粒着色鉴定原理：凡有活力的种胚在呼吸作用过程中都有氧化还原反应,而无活力的种胚则无此反应。当 TTC(2，3，5-氯化或溴化三苯基四氮唑简称四唑)溶液渗入种胚的活细胞内,并作为氢受体被脱氢辅酶上的氢还原时,便由无色的 TTC 变为红色的三苯基甲(TTF)，从而使种胚着色。当种胚生活力下降时,呼吸作用明显减弱,脱氢酶的活性亦大大下降,胚的颜色变化不明显,故可由染色的程度推知种子生活力强弱。,单倍体植株如何加倍,自然加倍（花粉植株并不象预期都是单倍体）人工诱导加倍（如：秋水仙素处理）从愈伤组织再生二倍体植株（单倍体植株再组培，诱导形成愈伤组织，经继代培养后，转化到分化培养基上，由此获得的再生植株，将会有染色体加倍的植株）,草莓花药愈伤组织,草莓花药再生植株,草莓花药植株（染色体加倍）,胚 胚乳 胚珠 子房,B、未受精的子房和卵细胞培养,由未授粉子房培养产生的单倍体植株来源和发育途径多种多样,B、未受精的子房和卵细胞培养,有助细胞或胚囊的无配子生殖产生单倍体 卵细胞、助细胞、反助细胞均可发育产生单倍体 非正常发育的大孢子四分体产生单倍体,四、单倍体植物的用途（育种）,大大缩短育种周期 有利于远缘杂交新类型的培育和稳定 与诱变育种相结合可加速育种进程 可作为外源基因转化的受体系统,大大缩短育种周期,常规杂交育种法和单倍体育种法遗传模式图,46年,如花粉培养仅需12年,前言 使用单细胞系统比使用完整的器官或植株有更大的优越性。使用游离细胞系统时，可以让各种化学药品和放射性物质很快作用于细胞，又能很快停止作用。通过单细胞克隆，可以将微生物的遗传学技术应用于高等植物的作物改良。,五、单细胞培养,1、单细胞的分离,由完整的植物器官分离单细胞a.机械法 将植物叶片放入研钵中 加入研磨介质轻轻研磨 匀浆用纱布过滤 在研磨介质中低速离心 分离出具光合活性和呼吸活性的叶肉细胞。,b、酶解法 优点：有可能得到海绵薄壁细胞或栅栏薄壁细胞的纯材料。,和酶解法相比，机械法具有的优点：细胞不会受到酶的伤害 无须质壁分离,2、由愈伤组织中分离单细胞,方法：将易散碎未分化的愈伤组织转入液体培养基中 常温、弱光（或黑暗）下震荡培养 继代、淘汰细胞碎片 得到单细胞或小细胞团。,震荡培养中震荡的作用:对细胞团施加缓和压力,使其破碎成小细胞团和单细胞 使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀分布 促进培养基和容器内空气之间的气体交换,为了获得充分分散的细胞悬浮液，应尽可能使用易散碎的愈伤组织，将愈伤组织在半固体培养基上保存23个继代周期，增加其松散性。在分批培养中，细胞数目增长的变化情况表现为一条S形曲线（如右图）：,对于单细胞、低密度悬浮细胞、或过于细小的细胞团，不宜直接转到半固体培养基上培养，先进行液体浅层培养或看护培养，待形成较大细胞团后，再转到半固体培养基上诱导愈伤组织。,3、单细胞培养,单细胞培养方法（1）.平板培养法该培养法为最常用的单细胞培养方法。,（2）.看护培养法,特点:把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织上培养,在愈伤组织和培养的细胞之间,用一块滤纸隔开。,植物花药看护培养图解,（3）微室培养法,特点：在培养过程中可以连续进行显微观察，把细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。,具体做法将滤纸的两端浸入液体培养基中，使滤纸的中央部分露出培养基表面，将所要的细胞放置于滤纸上进行培养。Bigot（1976）对该方法进行了改进，制作一特制三角瓶，使其底部一部分向上突起，在突起处放上滤纸，用这种方法的优点是培养物不易干燥。摘自：植物细胞组织培养,（4）纸桥培养法,影响单细胞培养的因子：培养基的成分和初始植板细胞密度是单细胞培养成败的关键。,总结,单倍体定义、分类及其特征单倍体如何产生（体内、离体）单倍体鉴定及二倍化方法单倍体植物的用途（育种）单细胞的获取与培养方法,