红景天促进大鼠烫伤创面模型皮肤愈合作用机制研究.docx

红景天促进大鼠烫伤创面模型皮肤愈合作用机制研究张同威I,郑文杰2,刘岩I,安立辉I1、沈阳市第七人民医院皮肤科，辽宁沈阳II(X)O32、中国医科大学附属第一医院皮肤科，辽宁沈阳I100ol【摘要】目的：探讨红景天对大鼠烫伤创面的愈合效果及其作用机制。方法：建立大鼠11度烫伤模型，90只大鼠随机分为阳性对照组(磺胺喀咤银软管单)、模型组、红景天低(7mgkg)、中(7.5mgkg)、高剂量(10mg/kg)组，以18只正常大鼠为对照组。在第7天、14天、21天观察大鼠烫伤创面的愈合情况以及检测创面组织含水量；给药结束后,HE染色观察大鼠创面组织病理学变化；ELISA法检测创面组织中Conangen-I水平、羟脯氨酸(HYP)及血清中、白细胞介素-l(IL-Ip)、肿瘤坏死因子-(TNF-)含量；Westernblot检测创面组织表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达。结果：与对照组相比，模型组大鼠创面组织表皮细胞脱落，炎性细胞浸润，胶原纤维排布散乱，ColIangen-I水平、HYP含量、EGF.bFGF蛋白表达水平均降低(P<0.05),含水量、TNF-a、IL-l水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，红景天低、中、高剂量组在不同程度上减轻了创伤大鼠的炎症反应，提高第7天、14天、21天创面愈合率以及HYP含量、Conangen-I水平、EGF、bFGF蛋白表达水平(P<0.05),缩短愈合时间，降低含水量、TNF-C1、IL-IP水平(PVO.05)。结论：红景天可促进烫伤模型大鼠创面愈合，其作用机制可能与抑制炎症反应，提高组织胶原蛋白合成有关。【关键词】红景天；烫伤大鼠；创面愈合；炎症反应ResearchontheMechanismofRhodiolaPromotingtheSkinHealingofRatModelsofScaldedWoundZhangTongweil,ZhengWenjie2,LiuYananLihui1!.DepartmentofDermatology,ShenyangSeventhPeople,sHospital,Shenyang110003,Liaoning2.DepartmentofDermatology,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,LiaoningAbstractObjective:ToinvestigatethehealingeffectofRhodiolaonscaldedwoundsinratsanditsmechanism.Methods:Ninetyratswererandomlydividedintopositivecontrolgroup(silversulfadiazineointment),modelgroup,rhodiolalow-dose(7mg/kg),medium-dose(7.5mg/kg)andhigh-dose(10mg/kg)groups,and18normalratswereusedascontrolgroupThehealingofscaldedwoundsinratswasobservedonthe7th,14th,and21stdays;aftertheadministration,HEstainingwasusedtoobservehistopathologicalchangesinthewoundsofrats;ELISAwasusedtodetectCollangen-Ilevel,hydroxyproline(HYP)contentinwoundtissuesandtheserumtumornecrosisfactor-(TNF-a),interleukin-l(IL-l)contents;Westernblotwasusedtodetecttheexpressionofepidermalgrowthfactor(EGF)andbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)inwoundtissuesofratsineachgroup.Results:Comparedwiththecontrolgroup,thewoundtissueepidermalcellsofratsinthemodelgroupfelloff,inflammatorycellsinfiltrated,collagenfibersarrangedindisorder,theCollangen-Ilevel,HYPcontent,andEGFandbFGFproteinexpressionlevelsreduced(P<0.05),theTNF-andIL-llevelsincreasedsignificantly(P<0.05);comparedwiththemodelgroup,theRhodiolalow,mediumandhighdosegroupsalleviatedtheinflammatoryresponseoftraumaticratstovaryingdegrees,improvedthewoundhealingrateonthe7th,14thand21stdays,HYPcontent,Collangen-Ilevel,andEGFandbFGFproteinexpressionlevels（P<0.05）,shortenthehealingtime,reducetheTNF-andIL-llevels（P<0.05）.Conclusion:Rhodiolacanpromotewoundhealinginscaldmodelrats,anditsmechanismofactionmayberelatedtoinhibitinginflammationandimprovingtissuecollagensynthesis.KeywordsRhodiola;scaldedrats;woundhealing;inflammatoryreaction烧伤和烫伤指的是患者接触温度较高的液体、金属、蒸汽或者气体导致的皮肤损伤，其发病率约为1.5%-2%3,轻者表现为红肿，损伤皮肤表层，严重者会出现水泡，创面发白或者呈灰褐色，骨骼、肌肉、器官均会出现不同程度的损伤，严重者影响危其生命安全，因此研究烧烫伤的作用机制和发掘有效治疗药物尤为重要。目前治疗烧伤和烫伤主要以抗生素和银盐为主的西药，这些药物不仅消炎、杀菌等作用效果差，还存在一定不良反应，而副作用小的中草药逐渐成为烧烫伤研究的重点。红景天又称蔷薇红景天，属多年生草本植物，具有抗病毒、抗炎、抗疲劳、抗氧化、保护血管等药用价值，应用前景较为广泛。本实验通过建立烫伤大鼠模型，使用红景天干预，观察大鼠创面愈合情况、炎症因子水平、蛋白表达情况，以揭示红景天对烫伤大鼠皮肤愈合的作用机制。方法1.l材料1.1.1 实验动物维通达生物技术有限公司提供清洁级SD大鼠108只，7周龄左右，体重约为210-260g,生产许可证：SCXK（京）2019-0002O所有大鼠自由进食进水，环境控制20±2C,湿度50%。本研究经动物伦理委员会批准。1.1.2 实验试剂与仪器红景天胶囊（货号：）购自佳汇泰生物科技开发有限公司；肿瘤坏死因子-（tumournecrosisfactor-,TNF-a）（货号：ml002859）、羟脯氨酸（HYP）（货号：ml003360）、白细胞介素-IP（interleukin-l,IL-l）（货号：ml003057）ELlSA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；胶原蛋白-I（Collangen-I）ELlSA试剂盒购自于上海瑞番生物科技有限公司；兔抗鼠EGF、兔抗鼠bFGF（货号：ab184265sab208687）购自于abeam公司。磺胺嗑咤银软膏（产品编号：80501）购自昆明华润圣火药业有限公司。尼康SMZ745光学显微镜购自于上海普赫生物科技有限公司；三用恒温水浴箱购自上海赫田科学仪器有限公司；酶标仪购自上海美谷分子仪器有限公司。1.2 方法1.2.1 模型制备、分组所有大鼠术前禁食24h,采用周丽艳等烫伤大鼠模型方法造模。操作过程：剪去所有大鼠背部体毛（直径约4cm）,清洗、消毒，经腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，将大鼠背部放置于中间掏空的木板上、暴露脱毛区，将脱毛区浸入80的恒浴水箱中，保持15s,造成大约直径3cm的烫伤区域，当模型大鼠烫伤区域局部发白，出现水肿现象，提示造模成功。90只大鼠随机分为红景天低剂量（5mgkg）组、红景天中剂量（7.5mgkg）组、红景天（10mgkg）高剂量组、模型组、阳性对照（磺胺嗑咤银软膏，1g）组，以18只正常大鼠为对照组。药物组分别以相应剂量红景天腹腔注射，阳性对照组给予磺胺嗑咤银软膏外敷治疗，对照组和模型组大鼠给予生理盐水注射，1天/次，连续21天。1.2.2 创面愈合相关指标模型构建成功后，每组随机选取3只大鼠，每日观察大鼠创面愈合情况，记录创面完全上皮化时间；在给药第7天、14天、21天，各组随机选取6只大鼠，拍照分析大鼠创面面积，计算创面愈合率，创面愈合率=（原烫伤面积-未愈合烫伤面积）/原烫伤面积×oo%;创面愈合率分析结束后，除需要观察创面愈合的大鼠外，其余大鼠经腹部取血保存，用于后续ELISA检测；之后采用颈椎脱臼方法处死大鼠，取烫伤部位创面组织，一式两份，一份用生理盐水冲洗，置于10%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色；另一份置于-80冰箱中保存，用于后续检测。1.2.4 创面组织含水量测定每组选取3只大鼠，麻醉并处死后切取创面皮肤组织，冲洗干净后称重（WI）,80烤箱烘烤24h至恒重后称量（W2）,含水量（）=（Wl-W2）AVl×100%1.2.5HE染色观察大鼠创面组织病理学变化取上述1.2.2中适量创面组织，常规方法制备石蜡切片，经固定、脱水、染色、透明后封片，于镜下观察组织病理变化。1.2.6 ELISA法检测大鼠血清中TNF->IL-I水平及创面组织中Collangen-1HYP含量取上述1.2.2中储存血液及适量创面组织，离心取上清，按照EUSA试剂盒说明书进行检测CoHangen-I、HYP及TNF-a、IL-I水平。1.2.7 Westernblot法检测创面组织EGF、bFGE表达水平取1.2.2适量创面组织，提取组织总蛋白并对蛋白进行定量、电泳分离、转膜、抗体封闭后，分别按照1：2000稀释后加入兔抗鼠EGF、兔抗鼠bFGF并于4°C孵育过夜；经TBST洗涤，加入二抗室温孵育lh,ECL可视化蛋白，ImageJ软件蛋白表达水平。1.3 统计学分析SPSS22.0软件统计分析数据，计量资料以（元±s）表示，PV0.05时，代表差异具有统计学意义。单因素方差分析多组间数据，进一步比较用Snk-q检验。2 .结果2.1 比较各组大鼠创面愈合状况与模型组大鼠相比，红景天低、中、高剂量组大鼠创面愈合时间明显缩短（PV0.05）,第7天、14天、21天创面愈合率显著性增加（PVO.05）,随着红景天剂量的增加，创面愈合时间逐渐缩短，创面愈合率呈增加趋势；红景天高剂量组愈合指标与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；同组之间，第7天、14天、21天的创面创面愈合率两两相比，差异均具有统计学意义（PV0.05）。见表1。表1红景天对大鼠创面愈合指标的影响（无±s,n=3）组别创面愈合时间（d）创面愈合率（%）7d14d21d模型组27.23±3.1521.61±1.5747.69+3.34e65.29±4.43ef低剂量组22.86±2.35b26.67±3.68b56.56+3.21bc78.15÷4.67bcf中剂量组18.75±1.86bc34.24±3.24bc66.24+6.16bce88.53±3.64bcef高剂量组14.95±2.35bcd43.95+3.46bcd76.48±6.84bcde97.61±5.14bcdef阳性对照组14.52±1.54bcd43.64±325bcd77.21±6.68bcde98.25±8.38bcdef注：与模型组相比，bP<0.05;与低剂量组相比，cp<0.05;与中剂量组相比,dP<0.05;与同组第7天比较，eP<0.05;与同组第14天比较，6<0.05。2.2红景天对大鼠创面组织病理学变化的影响对照组无炎症反应，细胞结构完整，无脱落坏死的现象发生；模型组大鼠胶原纤维排布散乱，出现炎性细胞浸润及细胞脱落；与模型组相比，红景天剂量组均在不同程度上减轻了创伤大鼠的炎症反应，细胞分化良好，胶原纤维有序排列；其中以红景天高剂量恢更效果最佳，炎性细胞浸润现象基本消失，与阳性对照组差异不明显。见图2。对照组模型组低剂量组中剂量组高剂量组阳性对照组图2创伤组织病理学变化（x200）2.3 红景天对大鼠创面组织HYP含量、Collangen-1水平的影响与对照组相比，模型组大鼠HYP含量、COHangen-I水平均降低（PVo.05）,差异具有统计学意义；与模型组相比，红景天剂量组HYP含量、COnangen-I水平均显著性增加（P<0.05）O见表2。表2红景天对创伤大鼠HYP含量、COllangen-I水平的影响（天±s,n=l2）组别HYP(gmg)Collangen-I(pg/mL)对照组19.76+0.71110.65+10.68模型组14.34+0.46a35.84+3.64a低剂量组22.86±0.48b49.61±5.67b中剂量组26.31±0.56bc61.38±5.94bc高剂量组31.16±0.53bcd73.34+6.48bcd阳性对照组31.56±0.72bcd75.34±7.62bcd注：同表1（a-d）o2.4 红景天对大鼠血清中炎症因子的影响血清中IL-l>TNF-含量：模型组较对照组增加（P<0.05）。红景天低、中、高剂量组较模型组降低（P<0.05）。见表3。表3红景天对创伤大鼠炎症因子水平的影响（元±s,n=12,PgZmL）对照组模型组低剂量组中剂量组ll.28±1.2648.35±4.68a36.28±3.49b25.84±2.34bc组别IL-lTNF-Q14.36±1.5360.35±5.86a42.38±4.03b29.35±2.85bc高剂量组18.64±2.0lbcd17.64±1.85bcd阳性对照组17.68±1.94bcd16.58±1.69bcd注：同表1（a-d）o2.5 红景天对大鼠含水量的影响与对照组相比，模型组含水量显著增加（PVO.O5）；经红景天干预后，含水量逐渐下降（P<O.O5）o见表4。表4红景天对含水量的影响（元±s,n=3,%）组别含水量对照组65.36+1.56模型组88.05±1.88a低剂量组81.05±1.79b中剂量组74.06±1.72bc高剂量组65.42±1.54bcd阳性对照组65.39±1.55bcd注：同表I（a-d）。2.6 红景天对大鼠创面组织bFGF、EGF蛋白表达的影响bFGF、EGF蛋白表达水平：模型组较对照组均降低（P<0.05）。红景天低、中、高剂量组较模型组均增加（P<0.05）。见图2、表5。ABCDEF图2大鼠创面组织bFGF、EGF蛋白免疫印迹图注：A为对照组；B为模型组；C为低剂量组；D为中剂量组；E为高剂量组；F为阳性对照组表5红景天对大鼠创面组织bFGF、EGF蛋白表达的影响（而土力n=12）组别bFGF-actinEGF-actin对照组0.93+0.110.96±0.09模型组0.13±0.02a0.14±0.02a低剂量组0.25±0.04b0.38±0.01b中剂量组0.59±0.06bc0.75±0.08bc高剂量组0.88±0.09ba,0.89±0.Ilb,阳性对照组0.96±0.10bal0.93±0.13bcd注：同表1(a-d)。3 .讨论烧伤和烫伤是日常生活和工作中最为常见的突发性疾病，严重程度主要与受伤范围和深度有关网。治疗烧烫伤的药物目前主要是以化学药为主，由于抗生素滥用，细菌耐药性以及化学药物本身的缺陷等均限制了这类药物的使用，而副作用较小的中草药引起人们的关注。因此本研究采用80°C水浴法建立大鼠11度烫伤模型，发现模型组大鼠出现表皮细胞脱落，炎性细胞浸润，胶原纤维排布散乱，提示大鼠11度烫伤模型构建成功，可进行下一步研究。红景天作为一类珍贵的中药材，在很多对疾病的治疗中发挥较好的药理价值。Wang等1网研究表明红景天可以抑制甲基乙二醛诱导的神经细胞凋亡，起到保护神经保护作用。曹兵等】研究发现红景天可以治疗大面积脑梗死，促进心理健康可用于进临床研究。郭爱民等研究证明红景天可以通过抑制炎症因子表达，提高应急刺激水平，对运动性肾缺血再灌注损伤起保护作用。但是红景天对烫伤创面的愈合鲜有报道。本研究发现，经不同剂量红景天干预后，可以在不同程度上减轻了创伤大鼠的炎症反应，提高创面愈合率，缩短愈合时间、含水量，减少炎症因子水平。研究表明，创面愈合是治疗烧伤和烫伤的关键。成纤维细胞分泌的胶原蛋白含量则是创面愈合的快慢的重要指标，在正常人体皮肤内，CoHangen-I含量占总胶原80%,起到支架作用，其中胶原蛋白的主要成分是HYP,参与形成人体皮肤，通过测定HYP含量和COnangen-I水平间接反映创面愈合情况1。本实验结果发现，不同剂量的红景天均可以提高HYP含量和COllangen-I水平，促进合成胶原蛋白，加快创面愈合。在创面愈合过程中，参与愈合的细胞比如血小板、神经细胞、内皮细胞等释放的细胞因子和生长因子均直接参与了创面愈合的各个阶段B/'EGF可以加快创面完全愈合，主要通过促进细胞分裂、加快蛋白合成、促进成纤维细胞增殖以及创面上皮化Ui%bFGF可以通过改善局部循环，促进内皮细胞增殖、肉芽组织生长。本实验结果显示，经红景天干预后，不同剂量红景天均可以提高EGF、bFGF蛋白表达。这表明红景天可能通过促进EGF、bFGF等生长因子表达，促进创面愈合。综上所述，红景天可以促进烫伤模型大鼠创面愈合，其作用机制可能与抑制炎症反应，提高组织胶原蛋白合成有关。但红景天促进烫伤模型大鼠创面愈合的作用可能还涉及其它机制，尚需深入研究。参考文献IU王旭文，齐杰，蔺利剑，等.美宝湿润烧伤膏联合抗菌药在烧伤创面治疗中的效果分析J.山西医药杂志,2016,45(23):2772-2774.2黄志群，韦斯，陆钢，等.中西药制剂治疗烧烫伤概述身.右江民族医学院学报，2013,35(2):196-197.3罗旭，王欣玲，赵胜，等.两种重组人生长激素治疗重度烧伤患者的临床疗效评价J中华危重症医学杂志(电子版),2016,9(1):47-48.4张明昊，陈四清，章金涛.新生鼠油对大鼠烫伤创面的治疗作用及可能机制研究J.中医药导报,2019,25(19):39-43.5浦春宁，陈骅，凌书建.大蒜素对大鼠烧伤创面愈合的影响及其机制J.中国中医急症,2020,29(11):1971-1975.6崔博慧，李龙，黄凌远，等.迪康凝胶对大鼠烫伤创面的治疗作用及可能机制研究J.成都医学院学报,2017,55(06):30-36.徐艳，张晓理，任红.红景天对蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛大鼠炎症介质水平及血管内皮功能的影响J.中国医师杂志,2018,20(2):238-242.8范佐旺，王丹，庞玉新，等.艾纳香油对大鼠深H度烫伤的治疗研究JL中医药信息,2014,31(6):93-96.9边海旭，伍晓晓，李伟，等.五谷虫提取物凝胶对大鼠深11度烫伤创面愈合的影响JL中国医院药学杂志,2017,37(4):363-367.10JWangCH,SafwanS,ChengMC,etal.ProtectiveEvaluationofCompoundsExtractedfromRootofRhodiolaroseaL.againstMethylglyoxal-InducedToxicityinaNeuronalCellLineJ.Molecules,2020,25(12):2801-2811.Ill曹兵，丁奇，刘熙鹏，等.大株红景天注射液治疗大面积脑梗死的临床研究J世界中医药,2017,12(001):79-82.112郭爱民，曹建民，周海涛.红景天对大鼠运动性肾缺血再灌注血清和肾组织中IL-l,TNF-,IL-6和IL-18水平的影响J.沈阳体育学院学报,2013,32:74-79.113王元元，黄云英，杜娟，等.蜂蜜、蜂胶对深11度烫伤大鼠创面愈合的影响J天津中医药大学学报,2012,31(3):154-156.14 OryanA,AlemzadehE,MoshiriA.Burnwoundhealing:presentconcepts,treatmentstrategiesandfuturedirections.11.JournalofWoundCare,2017,26(1):5-19.115付小兵，盛志勇.软组织创伤修复基础研究的现状与展望J解放军医学杂志，1997,22(1):12-13.16 ShuppJW,NasabzadehTJ,RosenthalDS,etal.AreviewofthelocalpathophysiologicbasesofbumwoundprogressionJ.JBurnCareRes,2010,31(6):849-873.17 SalibianA,RosarioA,SeveroL,etal.Currentconceptsonbumwoundconversion-AreviewofrecentadvancesinunderstandingthesecondaryprogressionsofburnsU.BurnsJournaloftheInternationalSocietyforBurnInjuries,2016,42(5):1025-1035.18 GokakinAK,DeveciK,KurtA,etal.Theprotectiveeffectsofsildenafilinacutelunginjuryinaratmodelofseverescaldburn:AbiochemicalandhistopathologicalstudyJ.BurnsJournaloftheInternationalSocietyforBurnInjuries,2013,39(6):1193-1199.119 TanN,JrH,SingerAJ.TheeffectofcontrolledmildhypothermiaonlargescaldburnsinaresuscitatedratmodelJJ.Clinical&ExperimentalEmergencyMedicine,2014,1(1):56-61.