化学生物学导论-第三章核酸4-5节.ppt
第三章核酸,Nucleic Acid,王骊丽,DNA碱基顺序的测定 RNA碱基顺序的测定,第四节 核酸碱基序列顺序分析(Sequence analysis of nucleic acids),DNA 碱基顺序测定的基本步骤,DNA 片断的制备DNA碱基顺序测定,DNA 片断的制备,由于DNA的分子量很大，需要先将DNA分子切割或能够用于测定的小片段，共包括部分：DNA分子酶解：将相对分子量质量大的片断用限制性内切酶技术完成，使切割成能够用于测定的小片段（300-500bp)；PCR技术扩增DNA片段：DNA片段数量少的情况下，以获取一定数量用于序列测定。,返回,杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法DNA 芯片法,化学降解法(Maxam-Gillbert法,1977)双脱氧链终止法(sanger法,1977),新技术方法,核酸序列分析Nucleic Acid Sequence Analysis,经典方法,一、以化学裂解反应为基础化学降解法,基本原理：基于有机化学方法，选择性地切断核苷酸（A、G、C或T）所形成的磷酸二酯键，得到不同链长的DNA小片段；将这些片段经电泳分离；分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。主要两个步骤：碱基选择性水解；对水解产物DNA小片段进行电泳分析和碱基顺序的推断。,硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中嘌呤碱基选择性水解，分别得到两种嘌呤碱基的甲基化产物：N3-甲基腺嘌呤核苷和N7-甲基鸟嘌呤核苷；肼：使DNA分子中嘧啶碱选择性水解，胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂，生成核糖腙衍生物；再在哌啶存在下水解，核糖腙3-位的磷酸酯键则被水解断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。,特异性碱基化学切割反应(1),G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。T+C反应：肼（低盐）C反应：肼（高盐）测定DNA长度250bp。,特异性碱基化学切割反应(2),化学裂解法测定DNA的核苷酸序列,返回,二、以使用DNA聚合酶为基础-DNA链末端终止法,基本原理：以DNA的酶促合成为基础，以被测DNA单链为模板，通过特殊设计的“末端终止技术合成出一系列相差一个核苷酸长度的互补链，然后利用凝胶电泳分离这些不同长度的DNA小片段，以此推测确定待测DNA链的碱基顺序。主要步骤包括：末端终止法合成不同长度DNA小片段；DNA小片段电泳图谱解析。,1977年sanger发明末端终止法“加减法”Sanger双脱氧终止法DNA酶法测序DNA自动测序仪,Sanger法发展过程,1、“加减法”测定DNA序列的原理,以待定片断的单链DNA为模板，首先加上一个适当的引物（一般用限制性内切酶解片段），再加入4种脱氧三磷酸（dNTP)为底物，其中一种用放射性同位素32P标记（例如32PdATP),再加入DNA聚合酶IKlenow片断；从引物3端合成出一条与模板互补的、具有放射性标记的dDNA 链混合物，反应尽量不同步，使合成的产物中各种长度的片断都存在，然后经过琼脂糖柱纯化，除去反应混合物中多余的4种dNTP,将纯化后的混合物分成两份，分别进行加减法反应系统。,*,少一个OH,脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸结构,2、双脱氧链终止法,基本原理：直接引入双脱氧核苷三磷酸作为链终止剂；将待定DNA片断分为4组，在反应体系中仍然以DNA单链为模板，需要引物、DNA聚合酶和4种dNTP(其中一种用32P/35S标记)、一定比例不同种类的终止剂2，3-双脱氧三磷酸(ddNTP，特异性末端终止剂)；在DNA合成反应混合物的4种dNTP加入少量的一种ddNTP后，链的延伸将与偶而发生但却非常特异的链终止竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。分别得到ddA ddT ddG ddC结尾的片段。,返回,3、DNA酶法测序,平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同 的引物以及四种脱氧核苷酸；在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的 四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离 开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测 DNA的核苷酸序列,如下图所示：,DNA酶法测序,三、DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,第一步 加入复制终止剂,荧光检测探头,电泳，看谁跑得快,ddNTPs参与下的DNA复制,Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP：dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；“标记终止法”测序产物的平均长度可通过标记反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反应的ddNTP:dNTP来调整。,第二步 荧光检测,DNA 带负电DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关,DNA自动测序结果,RNA 碱基顺序测定方法,RNA 链碱基顺序的测定比较复杂；逆转录法，以待测的RNA链为模板，在逆转录酶纯化下，合成DNA(与RNA互补的DNA分子，常用cDNA 表示)；用化学降解法 或双脱氧链终止法测定DNA碱基顺序，再得出RNA的碱基顺序。,应用一套已知序列的寡核苷酸探针去寻找靶DNA链上的互补序列，靶DNA上的序列根据杂交情况来确定。,杂交测序,一、化学正在向生命科学领域渗透。,二、DNA 测序的研究工作,历经了数十年,成绩辉煌,曾两次获得诺贝尔奖。而后基因组的研究工作是更有意义且更具挑战性的，它必将激发科学家更大的创造力！,分析化学的新发展,正在发展的几种测序方法,1）毛细管电泳激光荧光法2）超薄层板电泳激光荧光法3）八聚体测序技术4）转录测序5）质谱法6）原子探针显微镜7）流动式单分子荧光检测法8）芯片测序,核酸分子的核苷酸序列分析是以纯品核酸为材料，经水解，测定核苷酸组成及比例；先以外切酶确定5-或3-末端核苷酸，再以内切酶将核酸链分为若干寡核苷酸段，分段测定核苷酸组成、比例和序列；最后将核苷酸序列的各寡核苷酸重叠，确定整个核酸分子的核苷酸序列。,核酸碱基顺序测定,核苷酸序列分析中断裂磷酸二酯键用酶,返回,第五节 核酸的催化性质The catalytic properties of nucleic acids,核酶（Ribozyme）,核酶的发现核酶的催化性质核酶的研究中的两个问题,核酶的发现,Altman发现RNase-P的蛋白部分不具催化功能，而RNA部分在有足够浓度Mg2+离子存在下，能起核酸水解酶的作用。Cech发现RNA原生动物四膜虫的Pre-rRNA是一种具有自催化性能的核酶。证明了核酸既是信息分子，又是功能分子,核 酶,催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。,催化性RNA(ribozyme)序列特异性的核酸内切酶参与RNA转录后加工修饰作为针对病毒或肿瘤基因的药物降解mRNA。,核酶的催化性质,RNA作用于RNA核酸酶催化的反应主要包括:水解反应(RNA限制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转核苷酰反应等。最近核酸酶的其他作用底物也已被发现，如多糖、DNA以及氨基酸酯等。,核酶的催化过程图,转酯作用,转酯作用,核酸酶是指所有可以水解核酸的酶依据底物不同分类DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)RNA酶(ribonuclease,RNase)依据切割部位不同分类核酸内切酶：限制性核酸内切酶 非特异性核酸内切酶核酸外切酶：53或35核酸外切酶。,参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 体外重组DNA技术中的重要工具酶,生物体内的核酸酶负责催化细胞内外核酸的降解,核酸酶的功能,The crystal structure of the L1 ligase ribozyme.(Credit:M.Robertson and W.Scott(Science,March 16,2007),“谁先出现的呢，核酸还是蛋白质？”这个问题先前被看作是一个极难处理的矛盾，但随着核酶的发现，现在可以想象一个生命起源以前的RNA世界，那里自我复制的酶执行两种功能。,科学杂志期刊,X射线衍射技术确定核酶晶体结构,The Structural Basis of Ribozyme-Catalyzed RNA Assembly Michael P.Robertson and William G.ScottScience 16 March 2007:1549-1553.A SYNTHETIC RIBOZYME CATALYZES THE BOND FORMATION NECESSARY FOR RNA SYNTHESIS BY TRANSITION-STATE STABILIZATION AND ACID-BASE CATALYSIS,PERHAPS AS IN AN EARLY RNA WORLD.Abstract|Full Text|PDF|Supporting Online Material|,核酶催化效率太低由于核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶(RNase)所破坏因此，要将核酶应用于体内阻断基因表达或作为抗病毒的临床药物，还要做大量的研究工作。,核酶的研究中的两个问题,
