化学物质与酶的相互作用.ppt

第七章,化学物质与酶的相互作用,Interaction between chemicals and enzymes,主要内容,化学物质对酶的抑制作用Inhibition of enzymes by chemicals化学物质对酶的激活作用Activation of enzymes by chemicals酶对化学物质的催化作用Enzymatic catalysis of chemical substances,教学要求,熟练掌握抑制作用的类型，动力学特性以及抑制剂研究的意义；掌握酶激活作用的类型、动力学特性；掌握酶对化学物质的催化作用；掌握酶制剂的类型、催化反应的介质以及酶催化的有机合成反应类型。,化学物质与酶的相互作用,自然界中发现的酶已达3000多种，而且这个数目随着基因工程和蛋白质工程方面研究的发展而大大增加。酶可以直接作为药物用于医药工业，如溶菌酶可治疗各类炎症（咽喉炎、口腔溃疡、慢性鼻炎、带状疤疹及各种刀伤引起的发炎等），天冬酞胺酶治疗癌症，治疗血栓的尿激酶等。酶也广泛应用于食品工业、化学工业、医药工业、环保工业等，在临床检验、生物分析等领域也广泛使用。,本章主要知识点,化学物质（无机物质、有机物质和高分子物质）与酶的相互作用包括化学物质对酶的抑制作用、激活作用酶对化学物质的催化作用。,第一节,化学物质对酶的抑制作用,Inhibition of enzymes by chemicals,化学物质对酶的抑制作用,酶的抑制作用：凡能降低酶促反应速度的作用。通过酶抑制作用的研究，不仅对了解酶的专性，酶活性部位的物理和化学结构，酶的动力学性质以及酶的作用机制等；对了解药物和毒物作用于机体的方式及机理等也有重要意义；对代谢途径中酶的调节也能提供信息。酶的抑制剂（inhibitor）：能使酶活性受抑制的物质。抑制剂能抑制酶促反应，主要是抑制剂能使酶的必需基因或活性部位的性质和结构发生改变，从而导致酶活性降低或丧失。,抑制剂的分类,按抑制剂作用的方式不同，酶的抑制作用两种类型 类型：不可逆抑制剂 可逆抑制剂 应用：研制杀虫剂、药物 研究酶的作用机理，确定代谢途径,半数有效浓度,为了评价化合物对酶的抑制活性，用半数有效浓度IC50。测定IC50方法：将底物与酶的浓度保持恒定，改变抑制剂的浓度，求出使酶活性降低50%所需的抑制剂浓度。,一、可逆抑制作用,按可逆抑制剂对酶底结合的影响不同，可分为许多类型，它们的反应历程可用一通式表示：,速度方程通式,根据此反应历程,根据快速平衡学说或恒态学说推导，得到其总速度方程通式如下,在不同的抑制作用中，仅在于EI的解离常数Ki和EIS的解离常数Ki两个数值的不同，一般可分为4种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合性抑制作用。,将该方程作双倒数处理，可得,可逆抑制作用的类型和特点,1、竞争性抑制作用,竞争性抑制作用（Competitive inhibition）中I只与自由酶结合，因而阻止S与酶结合。而S又不能与EI结合，I也不能与ES结合，所以EIS不存在；EI亦不能分解成产物。反应历程：,竞争性抑制作用的特点,个竞争性抑制剂只增加酶底结合的表观米氏常数Km(Kmapp)，即抑制剂I浓度增加，Kmapp就增加；而Vmax则保持不变。在竞争性抑制剂存在下,要达到最大反应速度Vmax，必须加入更高的底物浓度。如S100Km时，Vmaxi可达Vmax。竞争性抑制剂对酶促反应的抑制程度，决定于I，S，Km和Ki的大小。I一定，增加S,减少抑制程度；S一定，增加I，增加抑制程度，Ki值较低时，任何给定I和S，抑制程度都较大；Km值越低，在一定S、I下，抑制程度越小。,竞争性抑制作用的双倒数图,在不同的固定I下，改变S并测定相应S下，如图所示,图中：有竞争性抑制剂存在，不管I如何，其双倒数图的纵截距不变，仍为1/Vmax,而横截距则随I的增加其负值增加，如I 达饱和浓度，则可使初始速度降为零，Vmax unchanged,Km increases,竞争性抑制作用Ki的求解,从双倒数图计算出表观米氏常数Kmapp，然后代入Kmapp=Km(1+I/Ki)可计算出Ki。从双倒数图求得各I浓度下的Kmapp值对相应I再作图，从再制图的纵截距可直接测得Km，从其横截距可直接测得Ki。从不同固定I下所作一簇直线的斜率1/S对相应I再制图，其纵截距为Km/Vmax,斜率为Km/VmaxKi，横截距即为-Ki。Dixon作图法求Ki,Dixon作图法求Ki,将竞争性抑制剂存在下的双倒数重排成1/v随I而变化的方程,竞争性抑制剂的IC50值,取决于实验所用的酶和底物浓度，当酶的浓度固定时，IC50值与Ki、Km和底物浓度S呈如下关系：根据该方程式，当底物浓度大于Km值时，IC50值高于Ki值，尤其当底物浓度较高时，Ki值偏低更加明显。,竞争性抑制剂的结构特征,底物类似物过渡态类似物其他化合物,利用酶底物类似物作为竞争性抑制研究一些三维结构不清楚的酶活性中心结构；根据底物结构设计临床药物。,底物类似物,实例1,-葡糖苷酶抑制剂如阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖（voglibose）和米格列醇（Miglitol）的结构与酶的低聚糖类底物和葡萄糖糖苷类相似。可与活性部位发生竞争性结合，抑制肠道内双糖分解，从而降低餐后的高血糖。,黄嘌呤氧化酶可催化次黄嘌呤氧化成黄嘌呤，进而被氧化成尿酸，黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇治疗痛风病就是通过抑制黄嘌呤氧化酶，降低尿酸的生物合成。,实例2,返回,过渡态类似物,酶催化化学反应效率高的原因在于酶能与高能态的过渡态相结合，从而大大降低了化学反应的活化能。如果对催化某一特定生物化学反应的酶的三维结构尚不清楚，可以根据其生化反应的过程，设计合成具有特定结构、疏水性匹配、电子和空间因素与过渡态类似的稳定化合物，作为该酶特异的抑制剂，这无疑为药物合理分子设计提供了另一强有力的手段。,AChE的羟基与酯酶的酯解部位形成共价键，其四价氮上的强正电荷与酯酶的阴离子部位呈静电联接。酶的乙酰化很快导致酯键断裂和胆碱的消除，乙酰化酶随即与水反应而使酶再生并放出乙酸。氨基甲酸酯杀虫剂是乙酰胆碱酯酶水解过渡态的稳定类似物，能与乙酰胆碱酯酶结合部位紧密结合而抑制乙酰胆碱酯酶。,乙酰胆碱酯酶(AChE),实例,苯甲酰丙氨醛是胰凝乳蛋白酶的过渡态抑制剂；其结构类似底物苯甲酰苯丙氨酰化合物与酶形成的共价中间物中的底物酰基部分，比底物中的肽键羰基更易受到酶活性中心羟基的亲核进攻，但不能形成酰化酶共价中间物。,返回,其它化合物,有些化合物的平面结构与底物并不相似，但立体构象十分相近，也可以成为竞争性抑制剂。,非甾体抗炎药,非甾体抗炎药是一类具有不同结构类型的化合物，由于选择性地抑制环氧合酶的活性，用作抗炎止痛药。环氧合酶抑制剂消炎痛和底物花生四烯酸的三维结构，整个分子的立体构象中，羧基和双键的配置有某种相似性，因而竞争性地与环氧合酶结合。,作为环氧合酶（COX2，炎症细胞产生的酶）的特异性抑制剂，难以进入开口较小的COX1活性中心的通道，故而不能对其产生抑制作用，但仍能进入口径稍大，后段略有柔性的COX2通道，而能对COX2产生抑制作用。,塞来克西(Celebrex),某些竞争性抑制剂的化学结构与底物的结构没有任何关系，其抑制作用的原理是抑制剂与一些酶活性中心的金属离子络合，妨碍了底物的进入，从而起到抑制酶活性的目的。LOX的活性中心含有一个非血红素铁原子，通过Fe2+与Fe3+的循环实现其催化功能。该酶的抑制剂（CGS-23885,A-76745）就是通过铁的螯合而与底物竞争性地与酶活性中心结合。,5-脂氧合酶(LOX),2、非竞争性抑制作用,典型的非竞争性抑制剂不影响酶-底物结合；底物也不影响酶-I的结合；S和I都可可逆独立地结合于酶的不同部位上；并且ESI为端点复合物。,非竞争性抑制作用的双倒数方程,非竞争性抑制作用Ki 的求解,从I0和I为某一固定浓度所作1/对1/S双倒数图的纵截距可直接测得1/Vmax和(1/Vmax)(1+I/Ki)，从而计算出Ki。从不同固定I所作双倒数图的斜率1/S对I再制图可求得Ki。从不同固定I所作双曲数图的纵截距对I再制图，从其横截距可直接到得Ki。,Dixon作图法求Ki,非竞争性抑制剂的IC50值,非竞争性抑制剂的IC50值与底物浓度的关系如下：根据该式，当底物浓度较高时，IC50值接近于Ki值；当底物浓度较低时，IC50值明显低于Ki值。,非竞争性抑制剂的结构特征,由于非竞争性抑制剂并非结合于酶活性中心的底物结合位点，而是活性中心附近的某些区域或基团，不影响酶与底物的亲和力。而非竞争性抑制剂的作用部位不是十分清楚，所以，不能根据酶的底物及酶活性中心的结构设计非竞争性抑制剂。目前所发现的一些酶的非竞争性抑制剂大多数都是随机筛选得到的化合物。,Genistein对于-葡萄糖苷酶的抑制作用就是非竞争性抑制作用。他克林(tacrine)是治疗老年痴呆症的乙酰胆碱酯酶的非竞争性抑制剂。,染料木素（genistein）,3、反竞争性抑制作用,反竞争性抑制剂I不能与自由酶结合，而只能与ES可逆结合生成不能分解成产物的EIS。这一点与竞争性抑制相反，Ki值为，EIS只能解离成ES+I，而不能解离成EI+S。,反竞争性抑制程度取决于I、S、Ki和Km等。它的抑制程度随底物浓度的增加而增加。反竞争性抑制剂使酶的Km值降低，即KmappKm。从这点看，反竞争性抑制剂不是一个抑制剂，而像是一个激活剂。它之所以造成对酶促反应的抑制作用，完全是由于它使Vmax降低而引起。所以如果S很小，反应主要为一级反应，则抑制剂对Vmax的影响几乎完全被对Km的相反影响所抵消。这时几乎看不到抑制作用。,反竞争性抑制作用的特点,反竞争性抑制作用的双倒数方程,反竞争性抑制剂的结构特征,反竞争性抑制在单底物酶催化反应中比较少见胎盘碱性磷酸酯酶以葡萄糖-6-磷酸或-萘酚磷酸酯为底物时，L-苯丙氨酸为反竞争性抑制剂；顺铂对乙酰胆碱酯酶的抑制作用也是属于反竞争类型。,在双底物反应中，反竞争性抑制比较多见，如乒乓机制的酶促反应时，因为I可以与EB复合物结合，对一个底物（A）表现竞争性抑制的化合物（I）对另一个底物（B）呈现反竞争性抑制。抗坏血酸对兔肌乳酸脱氢酶的抑制作用，抗坏血酸相对于NADH表现为乳酸脱氢酶的反竞争抑制，相对于丙酮酸为乳酸脱氢酶的竞争性抑制剂。,抗坏血酸,HIV-1 protease,4、混合性抑制作用,混合性抑制作用中S和E或EI都能够结合，I也可和E或ES结合，但亲和力都不相等，表明S和I对酶的结合互有影响，Ki和Ki两者既不等于无穷大，又互不相等，Ksi和Ks也不相等。有关可逆抑制作用的通式就是混合性抑制作用的公式。,当用双倒数方程作图时，有抑制剂和无抑制剂的直线既不平行，又不相交于纵轴或横轴，而是相交于横轴负侧的上方（第二象限）或下方（第三象限）,双倒数方程作图,5、四种类型可逆抑制的比较,不同类型的可逆抑制作用可以利用双倒数作图法来区别根据图中有无抑制剂时的直线是否相交于1/S轴，还是1/V轴就可以区别。,Vmax decreases,Km increases.,二、不可逆抑制作用,这类抑制作用的抑制剂与酶分子上的某基团以牢固的共价健结合使酶失活。不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。不可逆抑制作用的特点是随时间的延长会逐渐地增加抑制，最后达到完全抑制。,不可逆抑制作用的类型和特点,抑制剂是作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶的失活。类型有,1、非专一性不可逆抑制作用,这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。实例：有机磷杀虫剂,2、专一性不可逆抑制剂,这类抑制剂呈现其活性是在酶的催化过程实现的。这类抑制剂的结构与底物有很大相似性，与酶分子有较高的亲和力，它本身无化学活性或者没有化学活性基团，但在酶的催化作用下，产生了化学活性的亲电性基团，从而与酶的活性部位处的 亲核性基团发生不可逆的 结合反应，使酶失活。,3、酶自杀性底物的抑制作用,Ks型：一种抑制剂只作用于酶分子中一种氨基酸侧链基团，该氨基酸残基属于酶的必需基团。如：有机汞：专一作用于巯基；有机磷农药：专一作用于丝氨酸羟基，如乐果、敌百虫Kcat型：抑制剂为底物的类似物，但其结构中潜藏着一种化学活性基团，在酶的作用下，潜在的化学活性基团被激活，与酶的活性中心发生共价结合，不能再分解，酶因此失活。,自杀性底物,自杀性底物具有以下的结构特征和性能,(1)同正常底物的化学结构具有相似性；(2)可以同酶结合成复合物，有较大的亲和力；(3)在通常状态下，有低反应性能或化学惰性的基团或结构片断；(4)在酶的催化阶段，可将惰性基团转化为反应性能强的中间体；(5)与酶的活性部位发生化学反应，特别是共价键合，使酶不可逆失活。,酶自杀性底物的功能基团类型,基于它与正常底物的结构相似性、这是酶与该抑制剂结合成复合物并经催化反应暴露出活性基团的前提。所暴露出的反应活性基团大多是亲电基团。,酶的自杀性底物的特异性,醛、酮、亚胺或酯等与酶分子的亲核基团发生迈克尔加成反应 生成的负碳型中间体被负电性的羰基共振稳定化，使邻位碳发生消去反应或去质子化，生成邻位不饱和键。,不饱和羰基,4、指向活性部位抑制剂,指向活性部位抑制剂的作用特征是,抑制剂分子中含有化学活泼的功能基，它与酶的活性部位处的基团或原子发生共价结合，使酶失活。这类抑制剂的结构类似于酶的底物，可被酶的活性部位识别。可用于酶活性中心的结构研究，也称为亲和标记试剂。指向活性部位的不可逆抑制剂的化学活性基团多为亲电试剂，与其发生反应的酶活性部位的基团则是亲核性基团，形成共价键。,第二节,化学物质对酶的激活作用,Activation of enzymes by chemicals,化学物质对酶的激活作用,有些化学物质的作用与抑制剂的作用相反，对酶起着激活作用，加强酶作用的效果。在某些情况下，只有在激活剂的存在下，酶催化反应才能进行，或者说只有在激活剂的存在下催化反应速度才能测得出来。激活剂：凡是能提高酶活性的物质；激活剂一般是无机离子活简单的有机化合物，而高分子物质较少。,一、激活剂的类型,激活剂的类型除了在生物体内起激活作用的蛋白质分子（如酶原激活）以外，按照分子的大小可以分为三种类型。即：无机离子、有机分子和高分子物质。,1、具有巯基的还原剂,半胱氨酸、2-巯基乙醇和还原型谷胱甘肽等都含有巯基，可以使酶分子中被氧化的-SH基还原，从而提高酶的催化活力。如半胱氨酸、2-巯基乙醇和还原型谷胱甘肽等对腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、木瓜蛋白酶、蜡样芽胞杆菌蛋白酶、D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶等均具有激活作用。半胱氨酸(20mM)、2-巯基乙醇(10mM)和谷胱甘肽(10mM)分别使未活化的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的活性提高1.3、3.5和2.8倍。,巯基的配位作用,这些含有巯基的化合物还可以作为金属酶活性中心的轴向配体从而激活酶的催化作用，如巯基苯甲酸、巯基乙酸、半胱氨酸对细胞色素 P450、过氧化氢酶的激活作用。过氧化氢酶被巯基乙酸激活后，其km值减小、kcat/km增大，即巯基乙酸能够提高过氧化氢酶对底物的亲和力及底物专一性。巯基乙酸同样能够引起过氧化氢酶的可见光谱的蓝移及酶分子的色氨酸残基的荧光强度减小，从而使过氧化氢酶活性中心铁卟啉周围环境发生变化，以达到提高酶活力之目的。,2、多羟基化合物,多羟基化合物如甘油、乙二醇、糖类物质等不但可以作为酶的稳定剂使用，而且它们对许多酶具有激活作用。对腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶起激活作用的物质除了半胱氨酸、2-巯基乙醇和还原型谷胱甘肽等以外，3-磷酸甘油是其最有效的激活剂。乙二醇在0.33mol/L的浓度范围内对-葡萄糖醛酸苷酶具有激活作用，其激活机理可能是由于乙二醇与底物的水解产物-葡萄糖醛酸形成苷式结合，降低了产物抑制效应，从而提高了酶促反应，使酶的活性升高。,3、变性剂,某些变性剂如脲、盐酸胍等可以完全破坏酶蛋白的空间构象，使酶失去活性。但是当变性剂的浓度较低时，酶蛋白仅仅发生了部分变性。由于酶活性中心附近的多肽链的柔性，部分变性使活性中心的空间构象发生的改变，有利于底物的结合以及产物的离去，从而使酶的催化活性提高。,实例,在5C、20C、30C，鸡肝二氢叶酸还原酶随着盐酸胍的浓度增加而增高，经历一个激活过程后，再开始失活。2mol/L的脲可使二氢叶酸还原酶活力提高3.6倍，而且酶活力可以稳定12小时。4mol/L的脲可使二氢叶酸还原酶的催化活力提高大约5倍，但激活后的酶很快失去活力。,曲线1和2是在脲加入后立即检测，曲线3和4是在脲加入12小时后检测,4、有机溶剂,在某些情况下，低浓度的有机溶剂和表面活性剂可以有助于底物的溶解，同时也可以使酶分子部分变性，从而提高酶分子的催化活性。图中是甲醇、乙醇、丙醇和丁醇对青霉素V酰化酶的诱导激活过程，醇分子是以有机分子形式起作用。,表面活性剂,如Tween 80处理Bacillus megaterium酯酶，可使酶催化对硝基苯酚己酯的Km值降低，而Kcat/Km值提高14倍。非离子表面活性剂浓度在0.1%0.8%时，吐温80、聚乙二醇等作为纤维素酶的激活剂，可使纤维素酶活力提高20%-50%。而阴离子表面活性剂浓度在0.1%0.8%时，如十二烷基磺酸钠也可作为纤维素酶的激活剂。,5、小分子有机化合物,在有机胺类化合物（二乙胺、二异丙胺、三乙胺、吡啶等）的存在下，磷酸三酯酶的催化活性随着有机胺的浓度改变而变化；当有机胺浓度较低时，磷酸三酯酶的催化活性明显提高，显示出有机胺化合物对磷酸三酯酶的激活作用，但当有机胺的浓度增大时（0.1mol/L），则表现出较强的抑制作用。,6、高分子化合物,高分子化合物如聚乙烯亚胺、聚精氨酸、聚赖氨酸等聚电解质，在低浓度的溶液中可以与酶蛋白分子表面的相反电荷相互作用，多点的静电引力结合可能使酶活性中心附近的空间构象发生变化，从而提高酶的催化活力。如聚乙烯亚胺，聚丁基亚胺分别使乳酸脱氢酶活力提高3.0和 5.0倍。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对烟草硝酸还原酶也具有较强的激活作用。,二、激活作用的动力学,激活剂之所以能够提高酶的催化活性，其主要原因有两种：一是激活剂与酶分子结合，改变了酶活性中心及其附近的构象，从而增强了酶与底物的亲合能力，或者是增加了产物的离去速度，进而提高酶的催化活力；二是激活剂与底物分子结合再与酶分子结合，使底物分子的电子密度或分子张力发生变化，有利于产物的形成，从而提高酶催化活力。,1、激活剂A与酶形成EA活性复合物,激活动力学模型与抑制动力学模型采取一致的符号，可表示如下:,以稳态法处理可得到如下:,显而易见，此类型的激活剂只影响反应的Km值，并不影响Vmax。若和抑制剂的类型相类比，应属于竞争性活化。其倒数方程可表示如下：,反应速度方程式,A加大，斜率降低，反应速度增大，A降低，斜率增大，反应速度降低；A0,0。另外，当S=(在A存在的前提下)时,Vmax。若固定S，以1/1/A作图可求出KA：,激活剂A竞争性激活过程,对S1和S2不同底物浓度下所得到的1/1/A两直线相交于一点：1/A=-1/KA。,如果激活剂A与底物结合，其模型可表示如下：,2、激活剂与游离酶、酶-底物复合物结合,激活剂和酶结合不影响底物与酶结合底物结合也不影响激活剂与酶的结合。激活剂的作用只对酶的活性有影响，也就是说，末结合激活剂的ES复合物是无活性的，只有ESA三元复合物才有活性。以迅速平衡法得到如下方程：,激活剂与游离酶、酶-底物复合物结合关系,显然此种类型的激活剂只影响Vmax而不影响及Km，属于非竞争性活化作用。其倒数方程如下：,非竞争性活化作用,直线的斜率为（1+KA/A）Ks/Vmax，纵轴截距为（1+KA/A）/Vmax。横轴截距为-1/Ks(1/=0,1/S=-1/Ks)。若已知激活剂A的浓度和Vmax就可以计算出KA。以Dixon作图法也可以得到KA。当S为常数时，1/1/A作图是直线，而且S1和S2不同底物浓度下所得到的1/1/A两直线相交于一点：1/A=-1/KA。,第三节,酶对化学物质的催化作用,Enzymatic catalysis of chemical substances,酶对化学物质的催化作用,酶作为一种高效生物催化剂，它具有比化学催化剂更优越的性能。利用生物催化剂实现有机化合物的生物合成和生物转化是一门以有机合成化学为主，与生物学密切联系的交叉学科，它也是当今有机合成化学的研究热点和重要发展方向。酶不仅可以催化天然有机物质的生物转化，也能在生物体外催化天然的或人工合成的有机化合物的各种转化反应，并且显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性。因此，酶催化反应提供了许多常规化学方法不能或不易合成的化合物的合成方法，能合成和制备包括光学纯的医药、农药及中间体在内的复杂的功能化合物，是一个有利于环境保护的绿色化学过程。,一、酶制剂的类型,虽然自然界中发现的酶已达3000多种，但由于酶生产成本等方面的限制，工业上有价值的酶只有不到100种，能大规模生产和应用的只有十多种，如淀粉酶，蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、脂酶等。在酶催化的化学反应中，由于反应的类型，反应条件，反应体系以及完成底物转化的规模等因素，需要考虑所使用酶制剂的类型。为了提高酶制剂的稳定性和催化效率，可以对酶制剂本身进行修饰和改性，因此，在酶催化的化学反应中，除了使用溶液状态的酶制剂以外，还可采用以下酶制剂类型。,酶制剂的来源,1、完整细胞,某些含有较高酶活力的细胞（如微生物、植物细胞、动物细胞）组织、细胞器等，不经过分离直接用于催化反应，或用物理或化学方法使其与适当载体相结合，作为固定化催化剂利用。固定化细胞可省掉提取工艺，使酶的损失达到最低限度。有时可以利用细胞的复合酶系统催化几个有关反应。固定化细胞的方法主要有两种类型：即包埋法和共价交联法。,2、固定化酶,酶的固定化是通过物理或化学方法，将酶束缚在某种载体上，使酶只能在一定的空间内进行催化活动，底物通过扩散作用与酶接触并发生反应。在反应结束后，产物扩散到反应介质中与酶分离。而酶则可以重复进行催化作用。这种酶在反应体系中以固相形式存在，所以称为固定化酶或固相酶。固定化酶不仅保持了酶原有的性质，而且赋予了酶新的特性。例如固定化酶具有一定的机械强度，可以搅拌或装柱，易于回收和重复使用，产物容易分离，容易实现生产过程的连续化。另外，酶固定化后，可以提高对温度及酸碱稳定性。,3、修饰酶,化学修饰的目的是将酶分子表面的亲水基团改变为疏水基团，使得酶可以在有机介质中有效分散，溶解在有机溶剂中，从而提高酶的催化效率。典型的例子是用单甲氧基聚乙二醇共价修饰脂肪酶、过氧化物酶等的自由氨基，修饰酶能均匀溶于苯、氯仿等有机溶剂中，同时表现出较高的酶催化活性和稳定性。,采用聚乙二醇共价修饰Candida rugosa脂肪酶，在异辛烷中催化酯合成反应，酶催化活力比未修饰的酶提高数十倍；另外聚丙烯醇修饰、聚丙烯酸甲酯修饰、脂肪酸修饰酶在有机溶剂中也表现出较好的催化活性。酶分子表面以及活性中心的基团也可以与表面活性剂或脂肪酸相互作用，形成复合物。用非离子表面活性剂处理各种蛋白酶形成的复合物在无水有机溶剂中催化二肽的合成，酶催化活力可提高26倍。而采用硬脂酸处理脂肪酶和蛋白酶（对酶进行非共价修饰），修饰酶在有机溶剂中的酯交换活力提高了15倍，产物的光学收率达到100%ee。,二、酶催化反应的介质,将生物催化剂应用于有机合成是目前最吸引人的研究领域。有机化合物的生物合成和生物转化是一门以有机合成化学为主，与生物学密切联系的交叉学科，它也是当今有机合成化学的研究热点和重要发展方向。酶不仅在生物体内可以催化天然有机物质的生物转化，也能在生物体外促进天然的或人工合成的有机化合物的各种转化反应，并且显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性,1、水介质,水是酶促反应最常用的反应介质。在水溶液中采用游离酶催化化学反应不存在底物及产物的扩散问题。因为底物、产物和酶都处于溶解状态，底物容易进入酶的活性中心，产物也容易进入缓冲体系中。但是，对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂，因为许多有机化合物在水介质中难溶或不溶。而且，由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。,2、与水互溶的有机溶剂水单相体系,有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。这类溶剂主要包括二甲基甲酰胺 四氢呋喃,二氧六环,丙酮，乙醇和甲醇等。该体系主要用于脂溶性底物的转化反应。由于底物在水溶液中溶解度比较低,因而反应速度很低。在某些情况下，通过使用与水互溶的溶剂可以提高酯酶和蛋白酶的催化反应速度和选择性。但这种极性有机溶剂常常导致酶的变性，催化活力降低。,3、非极性有机溶剂水两相体系,由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。这类有机溶剂主要是碳氢化合物、酯、含氯碳氢化物等。这种体系对于从有机相中有效地分离酶是非常有利的。酶处在水溶液包围的环境中，不与有机溶剂直接接触。大部分底物溶解在有机相中。在水相中，底物或产物的有限浓度可以避免对酶产生的抑制作用。产物从酶分子表面脱落进入溶液中有利于反应向生成产物方向进行。,4、非极性有机溶剂酶悬浮体系,用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。虽然从表面上看酶是干的，但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。悬浮体系中，酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。酶在有机介质中良好的分散状态是提高酶促反应速度的关键。,5、反向胶束体系,反向胶束是表面活性剂分子在非极性溶剂中自发形成的热力学稳定的、光学透明的球形聚集体。从结构上看，反向胶束有一个由表面活性剂分子的烃链组成的外壳，疏水尾指向有机溶剂，极性头指向聚集体内部形成空腔,酶溶液被包在之中。由于反向胶束体系能够较好地模拟酶的天然环境，因而在反向胶束体系中，大多数酶能够保持催化活性，甚至表现出超活性。例如酪氨酸酶、酸性磷酸酶、辣根过氧化物酶在反向胶束中的催化速度分别提高50、100、200倍。,6、超临界流体,超临界流体除具有传统有机溶剂的所有优点外，还具有液体的高密度性、气体的高扩散系数、低粘度和低表面张力，使底物向酶的传质速度加快，从而使反应速度提高。超临界流体作为酶的反应介质，对酶促反应起着重要的作用,它能够改变酶的底物专一性，位置（或区域）选择性和对映体选择性，并能增强酶的稳定性。常用的超临界流体有CO2，SO2，CH2H4，C2H6，C3H8，C4H10等。其中以CO2最为常见，主要是因为它临界条件温和，利于酶保持生物活性。而且CO2价格便宜，无毒无污染，符合当今绿色化学发展的方向。,7、无溶剂体系,无溶剂有机合成体系有以下几种形式：（1）反应物均为液体；（2）一种反应物为固态，一种为液体；（3）两种反应物均为固体；（4）一种反应物为气体，另一种为固体。无溶剂有机合成反应具有污染少、成本低、反应过程和处理过程简单、产率高等特点目前酶催化的无溶剂有机合成反应中，使用的酶主要有脂肪酶、蛋白水解酶和糖苷酶。无溶剂酶催化反应主要包括以下几种反应体系：无溶剂体系（液态），固态-对-固态反应体系（包括低共熔混合物反应体系、超饱和底物反应体系）以及干介质反应体系。,三、酶催化的有机化学反应,生物催化剂用于手性合成、对映体拆分中，不仅可以催化多种化学反应，还可以合成结构复杂、具有生物活性的大分子和高分子化合物。同时，可以避开化学法进行手性合成与拆分时所需的手性试剂，以及产生的无效对映体和环保问题。为此，用生物催化方法进行化学合成又称为“绿色合成”。,用对映体过量值(ee)表示，或用对映体比率E值表示,式中ees表示底物的对映体过量，eep表示产物的对映体过量，其值通常在反应开始阶段(转化率20%)时测定。E值越大，表示酶的选择性越好；E值为1，表明酶对底物无选择性。,或,酶催化产物的光学纯度,表7-3 有机合成中常用的酶类和反应类型,主要反应类型,水解反应酯合成反应酰胺键的形成氧化还原反应裂解酶催化反应糖苷键形成反应酶催化高分子合成,1、水解反应,水解酶催化的各类反应一般不需要特殊的辅助因子，通过水解酶催化酯、环氧化物、酰胺等的水解反应，可以得到各种光学活性醇、酸、酯或胺。环氧化物水解腈类化合物的水解酰胺的水解 酯的水解,（1）环氧化物水解,环氧化物水解酶能催化环氧化物进行不对称水解。例如手性吡啶型环氧乙烷是制备一些手性药物的关键中间体，黑曲霉(Aspergillus niger)的环氧化物水解酶催化吡啶型环氧乙烷的水解反应可得到手性环氧化物，对映体过量98%。,（2）腈类化合物的水解,腈类化合物经酶法水解转化成相应的羧酸及其衍生物，是一种非常有用的合成方法。催化腈水解的酶系有两种类型：一种是腈水解酶，它催化腈直接水解，一步生成羧酸及NH3；另一种是腈水合酶，它催化腈水解生成酰胺，酰胺在酰胺酶的作用下，进一步转化成羧酸及NH3，反应过程需两步完成。,具有腈水合酶或腈水解酶活性的微生物酶可以转化腈。腈水合酶能将腈催化转化成相应的酰胺类化合物。如用丙烯腈生产丙烯酰胺，用3-氰基吡啶生产烟酰胺。而腈水解酶能催化腈转化成相应的羧酸和氨，如用3-氰基苯甲酸甲酯合成3-羧基苯甲酸甲酯。,实例,（3）酰胺的水解,酰胺类化合物的酶催化水解反应广泛应用与氨基酸拆分和青霉素、头孢霉素母核的生产中，所使用的酶主要是酰化酶类。还有一些蛋白酶、脂肪酶及酰胺酶也可以催化酰胺类化合物的水解。,实例,青霉素是人们经常使用的一种抗生素，但是，多年的使用使得不少病原菌对青霉素产生了抗药性。利用青霉素酰化酶，将青霉素母核（6-氨基青霉烷酸，6-APA）和侧链水解，然后，利用化学合成的方法，使青霉素的母核与其他的侧链连接起来，从而研制出氨苄青霉素等新型的青霉素。,头孢菌素类抗生素是一类抗菌谱广、抗菌活性强、疗效高、毒性低的抗生素。7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是医药工业生产半合成头孢菌素的重要中间体，国内外在工业上多采用化学法由头孢菌素C脱去其侧链来生产7-ACA。,戊二酰基-7-氨基头孢烷酸,实例,利用氨基酰化酶的高效专一性水解乙酰-L-氨基酸，将混旋的乙酰-D/L-氨基酸选择性水解得到L-氨基酸产品。未反应的乙酰-D-氨基酸再经过消旋化处理可重复使用。如蛋氨酸、苯丙氨酸等的拆分，可以得到99%ee的L-构型产物。,氨基酰化酶,某些脂肪酶也可以催化酰胺类化合物的选择性水解，得到光学活性的产物。如A.melleus脂肪酶催化N-(2-氟丙酰)-苯丙氨酸的水解，得到(S,R)构型的产物。,脂肪酶,（4）酯的水解,除了酯酶(esterase)、脂肪酶(lipase)可以催化酯的水解以外，许多蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶,胰蛋白酶,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等）不但能选择性地催化酰胺键的水解，也能选择性地水解氨基酸酯键。,一般产物的光学纯度为50-90%之间。为了提高产物的光学纯度,可以采取酶的修饰、底物修饰或选择适当反应溶剂等方法改进酶催化反应的选择性。-芳基或芳氧基的羧酸酯用羧酸酯酶催化水解，可得到高光学纯的产物。如：,实例：酶法水解拆分酯的手性异构体,蛋白水解酶能选择性水解由L-构型的氨基酸形成的酯，而对D-构型氨基酸所形成的酯不起催化作用。利用这种性质，可以将消旋化的氨基酸酯进行酶法拆分。,实例：蛋白水解酶,返回,2、酯合成反应,脂肪酶在水溶液中可催化油脂和其他酯类的水解反应，而在有机介质中它催化水解反应的逆反应酯合成反应及酯交换反应。脂肪酶催化酯合成反应的底物专一性取决于酶的类型，不同微生物来源的脂肪酶催化不同链长脂肪酸与不同链长脂肪醇的酯化反应。,(1)位置选择性酯化反应,除了简单的烷基二醇、氨基醇和甾族二醇外，脂肪酶也能催化碳水化合物的位置选择性酰化反应。如猪胰脂肪酶在吡啶中，采用高活性的脂肪酸(C2C12)三氯乙醇酯作为酰化剂催化葡萄糖等单糖的伯酰化反应，得到高度专一性的6-O-脂酰化葡萄糖。,手性1,3-丙二醇衍生物是许多生物活性物质合成的原料。以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸为原料，在有机溶剂介质中用脂肪酶(CCL)或猪肝酯酶（PLE）催化酯化反应，可得到较高光学纯度的R-或S-酯。,实例,（2）手性化合物的酶法拆分,手性的羟基酯虽然可通过酶催化水解拆分得到，但副反应较多，产率较低。如果拆分在有机介质中用脂肪酶(PSL)催化酯化进行拆分，可以避免副反应的发生。这个方法已经成功地用于-羟基-,-不饱和酯的拆分。,(3)内酯合成反应,在一定条件下，-羟基酸或它的酯在酶催化下，发生分子内环化作用得到内酯化合物。内酯可继续反应形成开链寡聚物。小于四元环或大于7元环的内酯是不稳定的,因此主要形成线性聚合产物。五元环内酯最容易形成。六元环内酯的形成常常伴随有部分直链寡聚物的形成。,返回,3、酰胺键形成反应,在有机介质中，许多酰胺水解酶类可以催化酰胺键的形成反应，如蛋白酶类、脂肪酶类以及酰化酶类（青霉素酰化酶等）。,（1）酰胺的合成反应,酯的酶催化氨解反应可以生成酰胺，这个反应具有良好的立体选择性，是合成手性酰胺的一种有价值的方法。例如枯草杆菌蛋白酶催化正丁酸三氟乙基酯的-甲基苄胺氨解，形成手性的酰胺化合物。,由于脂肪酶具有同蛋白水解酶相似的催化机制，因此它也可以催化胺类化合物的酰化反应和酯的胺解反应。,利用青霉素酰化酶催化青霉素水解反应的逆反应，人们采用超饱和体系或加入产物复合试剂等方法，合成了氨苄青霉素等抗生素，产率达80%以上。,（2）肽的合成,有机溶剂中酶催化的多肽合成，主要是利用蛋白酶催化的多肽水解逆反应,肽转移反应或氨解（氨基酸酯的氨解）反应进行的。,返回,4、氧化还原反应,催化氧化还原反应的酶类包括脱氢酶和氧化酶。这些酶可以催化羰基的还原、醇的氧化、烯烃的环氧化以及芳香烃的羟化反应。,（1）脱氢酶类,如醇脱氢酶可以催化羟基的氧化和羰基的还原的可逆反应，利用脱氢酶来还原羰基可以得到光学纯度极高的手性醇类化合物，反应需要辅酶NAD(P)H的参与。NAD(P)+和NAD(P)H的价格通常比酶促反应所得产物要贵得多，因此，有必要对辅酶进行再生并循环使用。目前用于NAD(P)+和NAD(P)H再生发展得比较完善的方法是酶法再生。酶法再生通常由合成体系和再生体系两部分组成，合成体系用来制备目的产物，再生体系则用于辅酶再生。再生中用得最多的酶是脱氢酶，其次有氧化酶、氢化酶等。,在有机介质中，将辅酶与酶一起吸附在载体表面的水穴中，载体上的辅因子能自由地进入和退出酶的活性部位而不会从载体上脱落到介质中，从而增加了辅因子的稳定性，提高了它的循环效率。有机介质中酶催化的氧化还原反应已经成功地应用于光学活性醛、酮和醇的制备。,有机介质中酶催化的氧化还原反应,实例1,许多脱氢酶，如酵母脱氢酶YADH和马肝醇脱氢酶HLADH等能将前手性酮还原为手性仲醇，它们催化酮还原反应的立体选择性遵循Prelog规则，如HLADH还原2-三环癸酮消旋体，产生手性醇。,甲酸/甲酸脱氢酶（FDH）再生体系已被用于工业生产L-叔亮氨酸、光学活性醇等的合成。,实例2,酵母中含有多种还原酶，能催化芳香族硝基化合物还原生成相应的苯胺，如酵母催化还原二硝基喹啉生成-6-硝基-5-氨基喹啉。,实例3,脱氢酶催化的反应是一种可逆反应，但是应用脱氢酶氧化醇得到相应酮的实例较少，如用马肝醇脱氢酶催化二羟甲基环戊烷（或己烷）脱氢得到的产物可用于许多光学纯药物的合成。含脱氢酶的微生物（Nocardia corallina）可选择性氧化拆分消旋的2-苯乙醇。,实例2,（2）氧化酶催化的反应,用于有机合成中参与氧化反应的酶有单加氧酶、双加氧酶、氧化酶和过氧化物酶等。利用单加氧酶和过氧化物酶催化氧化芳香族和脂环族有机物的反应尤其受人们注意。单加氧酶催化羟化反应：碳氢化合物中非活泼C-H键的羟化是一种非常有用的生物转化反应。传统有机化学合成中几乎不能进行这样的直接羟化反应，但在酶的催化作用下，能够发生选择性的羟化反应。,单加氧酶催化羟化反应,碳氢化合物中非活泼C-H键的羟化是一种非常有用的