罗氏实时荧光定量PCR仪.ppt
实时荧光定量PCR仪,一、实时荧光定量PCR的原理,荧光定量 PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。荧光定量 PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。,定量PCR技术的产生1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度PCR循环=双链DNA=染料=荧光后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB,荧光定量实时PCR与普通PCR的比较实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量结果分析更加快捷方便，无需跑胶,罗氏产品介绍以及与同类产品之间的对比,一、LC1.5和LC2.0,LightCycler荧光定量PCR系统,LC1.5,LC2.0,Lightcycler 1.5 结构分析,以空气加热及冷却迅速改变温度,带有极高表面积/容量比例的密封20l毛细管,加热线圈,可容纳32个样品的卡盘,将荧光仪定位的分档器发动机,将样品置于光学仪上的分档器发动机,热室,风扇,滤器,免维护的LED光源,光学倍增管,Lightcycler 2.0 结构分析,空气加热系统,LED激发光源,PMT检测系统,光纤,热力学结构,特点：1、空气加热 2、毛细管反应体系优点:1、升降温速度快（0.05-20/秒），2、体系均一，不存在边缘现象 3、把反应体系缩小到0-20ul，节省试剂成本 实现快速PCR,光学结构,特点：1、免维护的LED冷光源，寿命长达2万小时以上2、光学倍增管（Rodenstock）3、多达6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）实时检 测优点：1、毛细管光学特性将光线散射、衍射降至最低，避免LED 功率低的问题2、免维护，带自动检验功能3、轻易实现内标、内对照及多重PCR,LightCycler 结构分析,LightCycler 软件 4.0 更先进的自动定量方法全新的相对定量软件全自动熔点曲线分组全自动熔点温度提示简化数据和用户管理,PCR领域最聪明的革新 LightCycler荧光定量PCR系统,超高速 30至40分钟完成PCR过程实时在线监测 收集每一循环的数据并立即显示于联机电脑上高灵敏 在一个基因组当量中可检测出单基因拷贝范围广 可检测101010拷贝线性范围，无需稀释样品开放性 全开放，成为国内外试剂厂家的首选开发平台六个荧光通道 轻易实现内标、内对照或多重PCR最小化 定量反应体积降至1020ul，费用低廉灵活性 支持水解探针、杂交探针及 SYBR Green I闭管分析 消除污染风险,Lightcycler 的分析模式,适用于所有的通用探针及染料分析模式：SYBR Green I（荧光染料）TaqMan（水解探针）Molecular beacon（分子信标）Lightcycler上开发独有的分析模式：Hybridization Probe Format（杂交探针）SimpleProbe（单探针）,SYBR-Green I 检测模式 SYBR Green I能选择性地与双链DNA结合，在外界光源激发下产生强烈荧光。在PCR过程中，SYBR Green I可与新合成地双链DNA结合，产生地荧光信号强度与双链DNA含量成正比，荧光检测在每一循环的延期后进行。SYBR Green I与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合产生的干扰可通过融解曲线分析而得到解决。,水解探针（Taqman）检测模式 同时标记有荧光发光分子和荧光淬灭分子的一条探针在激发光作用下，发光分子所产生的荧光可被淬灭分子吸收，因而检测不到荧光。在PCR延伸时，因Taq酶具有的5，3，核酸外切酶活性，可降解荧光探针，使荧光发光分子与荧光淬灭分子分开，在外界光源激发下即可发出荧光，荧光强度与PCR扩增产物量有关。,分子信标（Molecular Beacon Probe）独特的颈环结构，由非特异的颈和特异的环组成，探针的5端标记荧光分子，3端 标记一个吸收或淬灭荧光的分子。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5端荧光分子与3端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。,杂交探针（HybProbe）检测模式 设计与检测区互补的分别带有不同染料标记的一对寡核苷酸（既杂交探针），在与扩增的DNA片断杂交时，两种染料互相接近。其中供体荧光染料受外来光源激发后，将能量传递给附近的受体染料，既发生荧光共振能量转移（FRET），从而释放出受体染料分子的发射波长荧光信号。荧光信号的强度和DNA的产量成正比。其他非特异性产物由于不会与探针杂交，因而不产生信号干扰。,for sequence specific detection of DNA,杂交探针检测罗氏专利性技术,Template:Plasmid;Target:CycA;Detection Format:Hybridization Probes,Standard Calculated concentration,9.522E+91.024E+99.433E+71.127E+71.029E+69.902E+41.021E+49.217E+29.276E+11.085E+1H2O,1.0E+101.0E+91.0E+81.0E+71.0E+61.0E+51.0E+41.0E+31.0E+21.0E+1H2O,杂交探针的优点：1.灵敏度高2.宽动力学范围3.特异性高4.可用于突变分析,Monitoring of PCR with the LightCyclerUsing Hybridization Probes,专用于SNP基因分型和突变检测的 SimpleProbe SimpleProbe作为一种独特的杂交探针只含有一条寡核苷酸探针，能够特异性的与目的基因上含有SNP位点的靶序列结合。探针与靶序列结合后，释放出能够被检测到的荧光信号，通过对熔点曲线分析中探针释放的荧光信号强度的分析，可以得到对目的基因的多态位点的准确分析结果。,Denaturation phase:SimpleProbe free in solution;emission of reporter dye is quenched,Annealing phase:Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to its complementary target,New Probe Format:SimpleProbe Format-高效低成本的新型探针,R=Reporter(Fluorescein)Q=Quencher,荧光定量PCR仪的部分应用,医学相关研究 疾病的临床早期诊断病原体的含量检测合理用药分子水平的疗效研究 疾病的发病监控研究 肿瘤相关基因肿瘤、耐药基因的检测研究组织或培养细胞中mRNA的表达水平 各种处理对细胞mRNA含量变化的影响 比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究基因分型及SNP分析转基因动物及植物研究,重点问题说明,超高速的热循环 由于采用空气迅速改变温度，以及利用有高表面积/体积比的光学玻璃毛细管模式，使升降温速度最高可达20/秒，温控0.2，每2030分钟便能完成3040个循环。升降温数率唯一可调可以根据实验的需要调整升降温速率的系统0.0520/秒，优化实验。,配套功能强大的分析软件：（1）绝对定量（具“单点定标”功能）（2）相对定量（可进行效率校正）（3）自动基因分型（SNP）（4）颜色干扰校正 独特的熔点曲线分析功能，可进一步作PCR后分析：-检测非特异扩增并作矫正-鉴别基因型而又无需采用测序凝胶-检测点突变，并可利用双色检测及颜色补偿软 件在同 一反应中分析较复杂的突变,为什么使用DNase-Free&RNase-Free 的光学玻璃 毛细管?玻璃反应管可加快热传导速率.毛细管增加表面积/体积比，确保空气和反应成分之间的 温度迅速平衡，温度均一.缩短了PCR反应时间，特别是荧光激发的时间，保证了 反应成分的稳定性，尤其是荧光染料的稳定性。缩小反应体系，降低检测成本。光学玻璃毛细管的材料适合荧光讯号的测定，类似光纤 的形状，保证荧光讯号的准确捕获。没有边缘效应.,LightCycler/毛细管/试剂的成本核算 仪器的维护费用 LightCycler是免维护的仪器,采用的光源是普通的发光二极管，寿命长达20000小时以上，非常稳定，价格低廉。而卤素灯光源，寿命2000小时，发光强度衰减明显，需要定期更换，价格昂贵。单一反应成本的计算 单一反应成本包括试剂成本和反应管成本，由于毛细管的反应体系是1020ul，而其他同类机器的反应体系是50ul，所以使用LC试剂的成本可以减少至少一半。,LC1.5与同质产品的对比,LC2.0与同质产品的对比,二、LC480,LightCycler480实时荧光定量PCR系统,高灵敏 可检测单拷贝基因动力学范围广 可检测101010个拷贝高重复性 重复性高，CV0.3高分辨率 轻松区分1000拷贝以下2倍浓度差异高速 40分钟完成40个PCR循环技术创新 采用Therma-BaseTM热循环专利技术 和先进的光学检测系 统，彻底消除边缘效应，保持稳定优异的检测结果。灵活 分析模式多样，绝对定量，相对定量，融解曲线分析等几乎 适用所有的检测模式（SYBR Green，Taqman Probe，Hybprobe，SimpleProbe等）模块化 可互换的96孔，384孔加热模块，用户可以自助更换模块，不需要工程师到场自动化平台 配以LIMS系统及自动进样机械臂，可实现远程操作及全 自动化运作用户界面友好 软件直观简洁，易操作,LightCycler480系统主要特点,LightCycler480系统主要参数,创新的PCR热循环模块设计,Therma-BaseTM 是一个内壁布满灯芯状毛细管结构的腔体，通过一系列的冷凝合蒸发，Therma-BaseTM 高效地传递热量，从而实现整板最大的温度均一性。,Therma-BaseTM核心优势 优异的空间温度均一性 快速、准确的温度调控 40个循环40分钟(384孔板),先进独特的光学系统,LC480系统使用宽光谱、高强度的氙灯作为光源。激发光经过多次反射后形成与孔板大小相同、光强均一的光柱，有效消除边缘效应。激发波长和发射波长的任意组合，使得多种荧光染料和检测模式可用于目前所有的实时荧光定量PCR实验。LC480光学系统的核心优势：最灵活地选择荧光染料及检测模式 整板数据的精确捕获 强大的多重PCR能力,多检测通道支持所有的检测模式 LightCycler 480系统支持目前所有检测模式的使用，包括杂交探针、SYBR Green I DNA结合染色、单探针、水解探针和分子信标等等。多色荧光检测系统，提供五色激发通道（450 nm,483 nm,523 nm,558 nm,615 nm）和六色荧光检测通道（500 nm,533 nm,568 nm,610 nm,640 nm,670 nm）,并具有颜色补偿功能；可自由选择，轻松实现多重或多色PCR。,公认的性能独特的软件,基于用户公认的LC480软件，新的LC480软件采用罗氏独特的算法来进行高度精确、自动化的数据分析。而且，新软件还提供了许多新的的特性，让用户能够轻松、省时地处理高通量的实验数据。LC480软件设计宗旨是为了用户需求量身定做。支持绝对定量、融解曲线分析、相对定量和自动基因分型等功能。LC480软件的核心优势：采用公认的优秀算法来分析数据友好的用户界面，简单的快捷方式，便于进行高通量样品编辑及数据处理。软件模块化，用户可根据自己的研究情况选择性安装。,模块系统概念,LightCycler 480在系统初始配置的基础上，还可根据客户的特别要求，通过在系统中添加各种先进的软件分析模块进行系统升级，满足用户不同阶段的研究需求。目前可提供的系统模块包括：定性检测 绝对定量分析 相对定量分析 统计分析工具 基因分型研究,良好的兼容性,LightCycler 480可顺利实现与现有实验室系统联结，包括LIMS或是与自动装载微孔板的工作站联用实现全流程的自动化操作。LightCycler 480系统增强流程管理及数据管理的能力：实现真正的自动化流程现代化的软件设计思路，可与LIMS连接兼容性符合数据管理要求（21 CFR-11条款）,LightCycler 480系统自动化装板过程,LightCycler480 与ABI 7900 HT 对比,
