琼脂免疫扩散试验.ppt

琼脂免疫扩散试验,一、相关知识介绍,可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,与沉淀原发生反应的抗体称为沉淀素（precipitin）。,亲水胶体转化为疏水胶体示意图,亲水胶体,疏水胶体,转化,NaCl,可见反应,二、琼脂扩散原理,12%琼脂凝胶所形成的构架网孔较大，空隙中是9899%的水，允许分子量在20万以下甚至更大些的大分子物质通过，绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在20万以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处发生特异性免疫结合反应，结合物分子量一般大于20万，此结合物因颗粒较大而不扩散，故形成沉淀带。,三、琼脂扩散的种类,琼脂扩散反应根据其扩散方向可分单相（向）扩散和双相扩散，根据抗原抗体二者是一方扩散还是双方扩散，又有单扩散和双扩散之别。因此，琼脂扩散反应就有单相单扩散、单相双扩散，双相扩散、双相双扩散4种类型。,四、以诊断禽流感为例讲解双相双扩散,（一）材料与试剂1标准禽流感诊断血清，购买自生物制品 所。2标准禽流感诊断抗原，购买自生物制品所。3待检血清4琼脂板 5打孔器,（二）操作方法（步骤）,1凝胶的配制 称取一定量的琼脂粉，按1%左右（0.81.5%）的比例加入8%盐水，水浴煮沸融化20min。2制板 将融化的琼脂倒入平板上，使厚度2mm3mm。自然冷却。,3打孔 根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径）按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。打成梅花形孔（共7孔）。用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。,4挑孔 挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。,5封底 把溶化琼脂7uL左右加入孔中，以免加样后液体从孔底渗漏。,6加样 以加样器（枪）吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。,7放置 加样完毕后，37自由扩散24h48h。,（三）结果判定,当标准阳性血清孔与抗原之间出现一条明显致密的沉淀线时，再进行被检血清孔的判定。若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。,