酶反应动力学技术研究.ppt
酶反应动力学技术研究食品工程学院08级生物工程（一班）孟昭旸,酶反应动力学,主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素 在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量5%时的反应速度。酶促反应动力学是研究酶促反应速率及其影响因素的科学。这些因素包括酶浓度、底物浓度、pH 值、温度、激活剂和抑制剂等。在实际生产中要充分发挥酶的催化作用，以较低的成本生产出较高质量的产品，就必须准确把握酶促反应的条件。,底物浓度对反应速度的影响,看底物对酶促反应的饱和现象，由实验观察到，在酶浓度不变时，不同的底物浓度与反应速度的关系为一矩形双曲线，即当底物浓度较低时，反应速度的增加与底物浓度的增加成正比（一级反应）；此后，随底物浓度的增加，反应速度的增加量逐渐减少（混合级反应）；最后，当底物浓度增加到一定量时，反应速度达到一最大值，不再随底物浓度的增加而增加（零级反应）。,米氏方程及米氏常数,根据上述实验结果，Michaelis&Menten 于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式，即米氏方程：=VmaxS/(Km+S)。其中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数,关于Km和Vmax的意义有以下论述：,当=Vmax/2时，Km=S。当k-1k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。Km可用于判断反应级数：当S100Km时，=Vmax，反应为零级反应当0.01KmS100Km时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应,关于Km和Vmax的意义有以下论述：,Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物,关于Km和Vmax的意义有以下论述：,Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当S=10Km时，=91%Vmax，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。Vmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。,酶的浓度对于反应速度的影响,当反应系统中底物的浓度足够大时，酶促反应速度与酶浓度成正比，即=kE。,其他因素对于酶促反应速度的影响,一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快，但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反应速度迅速下降 观察pH对酶促反应速度的影响，通常为一钟形曲线，即pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的pH值就称为酶的最适pH,酶的抑制剂,定义：凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质 分类：不可逆抑制作用和可逆抑制作用。,不可逆抑制作用,定义：抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用。分类：酶的不可逆抑制作用包括专一性抑制（如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制）和非专一性抑制（如路易斯气对巯基酶的抑制）两种。,可逆抑制作用,定义：抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制，且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用。分类：竞争性、反竞争性和非竞争性抑制几种类型。,可逆抑制作用,竞争性抑制：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低 特点：a.竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参数：Km值增大，Vm值不变。,可逆抑制作用,反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低。特点：a.抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；b.必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；c.动力学参数：Km减小，Vm降低。,可逆抑制作用,非竞争性抑制：抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低。特点:a.底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；b.抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；c.动力学参数：Km值不变，Vm值降低,酶的激活剂,定义：Km值不变，Vm值降低。能够促使酶促反应速度加快的物质。酶的激活剂大多数是金属离子，如K+、Mg2+、Mn2+等，唾液淀粉酶的激活剂为Cl-。,举例1：草甘膦N-乙酰转移酶反应动力学研究,酶反应动力学利用Thermo MULTISKANSPECTRUM酶标仪,通过连续分光光度分析法进行分析。将5L GAT酶液加入到295L的测活缓冲液(25mmol/L Hepes,pH 6.8,167mol/L AcCoA,10%乙二醇,0.12510.000 mmol/L草甘膦)中,以不加酶液的测活缓冲液作为对照。在235 nm处测定不同浓度梯度的草甘膦底物条件下的紫外分光光度值,每隔5 s读1次数,一直到60 s。通过不同草甘膦底物的浓度S下GAT催化转乙酰反应的反应速率v,以1/S为横坐标1/v为纵坐标,Lin-eweaver-Burk法双倒数作图,求出米氏常数KM和最大速率vmax,而催化常数kcat=vmax/E,E为酶浓度。具体测定方法参照文献2-3。GAT酶的活性用催化效率kcat/KM表示。数据处理软件为GraphPad Prism。,举例2:磁场和抑制剂对莲藕多酚氧化酶反应动力学的影响,通过添加Vc和外加磁场处理,研究莲藕多酚氧化酶(PPO)反应动力学的变化规律。以邻苯二酚为底物,莲藕PPO褐变反应动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学,Km为0775 mol/L,Vmax为11150 U/min。Vc对PPO有较强的抑制作用,反应动力学参数Km为0081 mol/L,Vmax为3243 U/min,呈现反竞争性抑制,表现为褐变出现滞后,随Vc浓度的增大滞后时间逐渐增长,且呈现S型趋势,并建立了相应的反应方程。不同磁场强度下,随着处理时间的变化,PPO活性呈现波动性。317 A/m磁场强度下处理4 h的酶液其反应动力学曲线表现为S型,并建立了相应的反应方程。,Thank You!,敬请期待，下期更精彩,
