酶动力学课件1财富值.ppt
酶促反应动力学(Enzyme Kinetics),反应进行的方向反应进行的可能性反应进行的限度反应进行的速率反应机制,化学热力学,化学动力学,研究酶促反应的速率以及影响反应速率的各种因素的科学.,影响反应速率因素包括:酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。,（一）.酶促反应动力学基础,酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度底物浓度远远大于酶浓度,单位时间底物浓度减少或产物浓度增加量,1.反应速率及其测定,2.反应分子数和反应级数,反应分子数(1)单分子反应 A B(2)双分子反应A+B C+D,V=-dc/dt=kc,V=-dc/dt=kc1c2,速率与反应物浓度的一次方成正比。二级反应 速率与反应物浓度的2次方（或两种物质的浓度的乘积）成正比。,一级反应,反应级数,零级反应 反应速率与反应物的浓度无关，为常数,速率常数与半衰期成反比，与反应物初浓度无关,对时间作图，为直线，斜率为K,半衰期与初浓度成反比,平衡常数,平衡：可逆反应的正向反应和逆向反应仍在继续进行，但反应速率相等的动态过程。反应的平衡常数与酶的活性无关，与反应速率的大小无关，而与反应体系的温度、反应物及产物浓度有关。,（二）底物浓度对酶反应速度的影响,1 中间络合物学说,Henri和Wurtz提出,中间产物的证据,中间复合物的直接观察光谱改变酶的物理性质改变分离结晶酶和底物的共沉降,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,酶反应的速度在不停地变，实验上只有初速度的测定才有意义。,2.单底物酶促反应动力学,（1）.米氏方程的提出1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程,S：底物浓度V：不同S时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity)m：米氏常数(Michaelis constant),（2）.米氏方程的推导,根据酶反应的中间复合物学说（快速平衡）,()S与E形成中间产物，且整个反应速度取决于 ES P+E()SE,两点假设,根据酶反应的中间复合物学说（快速平衡）,ES的生成速度K1（E-ES）SES的分解速度K2ES K1（E-ES）S,酶反应速度V与ES成正比 Vmax K3ES K3E,Briggs认为并不总是K3K2,ESE+P这一步也可能速度很快，这时，E，S和ES将不能处于一个平衡状态。布氏提出稳态理论。,Briggs和Haldane提出稳态平衡理论,酶催化的反应中各成份的变化,稳态理论的假设,游离酶浓度=E-ES ES生成速度=k1（E-ES）S ES分解速度=k2ES+k3ES 当稳态时：ES生成速度=ES分解速度 k1（E-ES）S=k2ES+k3ES,稳态米氏方程的推导,快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别,a当SKm时，v=(Vmax/Km)S,即v 与S成正比b当SKm时，v Vmax，即S而v不变c当SKm时，v=1/2Vmax,(3)米氏方程的讨论,.v-S曲线：近似双曲线 当SKm（S很小时）即v 与S成正比 当SKm（S很大时）v Vmax，酶被底物饱和，v与S无关 当v=1/2Vmax时，SKm（mol/L),A.Km值是酶的特征性常数。与酶的浓度无关，不同的酶，其Km值不同,Km 酶促反应速度为最大反应速度（Vmax)的一 半时的底物浓度。单位是mol/l。,动力学参数的意义,B.物理意义:酶促反应速度为最大反应速度（Vmax)的一 半时的底物浓度。,D.Km可判断酶的专一性和天然底物。如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都 有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。,C.Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关，不同的条件下有不同的Km值。,E.Km值近似等于ES的解离常数Ks，可表示酶与底物之间的亲和力：Km越大，亲和力越小，酶的催化活性低；Km越小，亲和力越大，酶的催化活性高,F.根据正逆反应Km的差别及细胞内正逆两相底物的浓度推测酶促反应的正逆方向。G.根据代谢途径中各个酶的Km及其相应底物浓度判断限速步骤。H.根据Km值的大小判断分支代谢的流向。,Km可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径:,丙酮酸,乳酸,乙酰CoA,乙醛,乳酸脱氢酶（1.710-5）,丙酮酸脱氢酶（1.310-3）,丙酮酸脱羧酶（1.010-3）,当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于Km最小的酶。,Vmax不是一个常数，它取决于酶的浓度，它是一个酶反应体系的速度的极限值。Vmax=K3 EK3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数或催化常数，（catalytic constant,Kcat）。Kcat值越大，表示酶的催化效率越高。,Vmax和k3(kcat),Kcat/Km,表示酶的实际催化效率,Kcat/Km是E和S反应形成产物的表观二级速率常数，也称为专一性常数。,只有Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率,(4)作图法测定Km和Vmax,Lineweaver-Burk 双倒数作图法Hanes-Woolf作图法Woolf-Augustinson-Hofstee作图法EisenthalCornish-Bowden作图法,测定Km和V的方法很多，最常用的是LineweaverBurk的作图法 双倒数作图法。,Lineweaver-Burk 双倒数作图法,实例,Neurospora crassa 的D-丝氨酸脱水酶催化反应：CH2OH CHNH2 COOH CH3CO COOH+NH3在实验中测定酶的饱和曲线得到下列数据：s v 10-5（M）20分钟生成丙酮酸（M）0.20 0.150 0.40 0.200 0.85 0.275 1.25 0.315 1.70 0.340 2.00 0.350 8.00 0.360,用这些数据求丝氨酸脱水酶的表观米氏常数。,vVm0.30.2Vm 20.1,0 1 2 3 4 5 6 7 8 10-6 S,丙酮酸M/20min,Vmax=0.36 1/2Vmax=0.18 Km=3.210-7,解：1、v对S作图法:,S 1/S v 1/v 0.20 5.0 0.150 6.66 0.40 2.5 0.200 5.00 0.85 1.17 0.275 3.64 1.25 0.80 0.315 3.17 1.70 0.58 0.340 2.94 2.00 0.50 0.350 2.86 8.00 0.125 0.360 2.78,解2、1/v 对1/S作图法：,7654321,-4-3-2-1 0 1 2 3 4 5,1/v,1/S,-1/Km=-2.8510 5 Km=3.51 10-6,1/Vm=2.55;Vm=0.39,(三）.pH对酶促反应速度的影响,最适pH：酶具有最大催化活性时的环境pH。典型的酶速度-pH曲线是较窄的钟罩型曲线。,最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。,（四）.温度对酶促反应速度的影响,提高温度，加快反应速度。温度系数Q10：温度升高10，反应速度与原来的反应速度之比，大多数酶的Q10一般为2。提高温度，酶变性失活。在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度(optimum temperature).,最适温不是酶的特征性常数。,（五）.酶浓度对酶促反应速度的影响,当S E，反应速度对酶浓度呈正比。关系式为：V=K3 E 机理：酶浓度增加，ES也增加，反应速度增加。,（六）.激活剂对酶促反应速度的影响,激活剂（activator):凡是能提高酶活性的物质无机离子的激活作用金属离子：K+、Mg2+、Zn2+阴离子：Cl-、Br 有机小分子化合物的激活作用蛋白酶对酶原的激活,（七）.抑制剂对酶活性的影响,六、酶促反应动力学(Enzyme Kinetics),（1）.抑制程度的表示方法,(2）抑制反应类型 巯基酶抑制剂*专一性抑制 丝氨酸酶抑制剂 不可逆抑制 非专一性抑制抑制作用*竞争性抑制作用 可逆性抑制 非竞争性抑制作用 反竞争性抑制作用,1.不可逆抑制作用（irreversible inhibition),I 以共价键与E活性中心上的必需基团 结合，从而抑制酶活性。这种I不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性.常见抑制剂丝氨酸酶抑制剂巯基酶抑制剂,如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。,这类抑制剂I与酶蛋白以非共价键结合，引起酶活力降低或丧失。可用透析，超滤等物理方法除去抑制剂I而恢复酶活性。类型：竞争性抑制(competitive inhibition)非竞争性抑制(noncompetitive inhibition)反竞争性抑制(uncompetitive inhibition),2.可逆抑制作用(reversible inhibition),.竞争性抑制,抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。,1.i与S结构相似；2.i与S互相竞争与酶活性中心结合；3.抑制程度取决于i 和S的相对比例；4.S，可以减少或去除抑制作用。（Km，Vmax不变）5.排斥性抑制,竞争性抑制的特点,.非竞争性抑制,抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，但形成中间的三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。,非竞争性抑制作用特点,1.i与S结构不相似；2.i与S互不干扰同时与 酶 结合；3.抑制程度只取决于i的浓度；4.S，不能去除抑制作用。（Km不变，Vmax）5.是一种旁若无人式的抑制,.反竞争性抑制,酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+SES+I ESI P常见于多底物的酶促反应中,(3)酶抑制作用的动力学,可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别透析、超滤、凝胶过滤能否除去抑制剂动力学方法：酶浓度对反应速度作图，不可逆抑制剂使直线右移，可逆抑制剂使直线的斜率下降。,Ki为抑制剂常数,即EI的解离平衡常数。为的解离平衡常数,：游离酶的浓度：酶的总浓度,1.竞争性抑制米氏方程的推导,与标准方程的比较,当 I 0时，方程还原成米氏方程。,I 时，,双倒数作图,Eo=E+ES+EI+EIS,当I0,I,与米氏方程比较,双倒数作图,抑制程度:,抑制程度决定于I，与底物S无关,与米氏方程比较,双倒数作图,不同类型抑制作用的米氏方程,非竞争性抑制,反竞争性抑制,竞争性抑制,（4）抑制剂,1.不可逆抑制剂,有机磷化合物 有机汞和有机砷化合物 重金属盐 烷化试剂 氰化物、硫化物和CO 青霉素,非专一性的不可逆抑制剂,与酶活性中心及活性中心外某一类或几类必需基团反应,巯基酶抑制剂,抑制剂：重金属离子：Ag+、Hg2+、As3+等,丝氨酸酶抑制剂,抑制剂：有机磷化合物,丝氨酸酶,2.可逆抑制剂,可逆抑制剂中最重要和最常见的是竞争性抑制剂 一些竞争性抑制剂与天然代谢物在结构上十分相似，能选择性的抑制病菌或癌细胞在代谢过程中的某些酶，而具有抗菌和抗癌作用。,竞争性抑制剂有：丙二酸、草酰乙酸等,琥珀酸脱氢酶,磺胺类药物的竞争性抑制作用,磺胺药与PABA相互竞争与FH2合成酶结合,(p-aminobenzoic acid,PABA）,sulfa drugs,PABA,二氢蝶呤啶,谷氨酸,FH2合成酶,磺胺类药物,FH2,FH2还原酶,MTX,FH4,相互竞争,相互竞争,磺胺类药物的抑菌机理,（-）,（-）,氨甲蝶呤（methotrexate,MTX）,促进核酸 的合成,基本要求1.熟悉化学动力学基础。2.掌握米氏方程及相关推导和计算。3.掌握酶抑制作用的有关概念、动力学特点和 酶抑制作用的应用。4.酶活性的测定与计算,The End,
