色谱分析法第九章毛细管电泳法简介.ppt

1,第九章毛细管电泳法简介,2,9.1.1简介 电泳(Electrophoresis)是指带电粒子或分子在电场的作用下在导电液体通常是水介质中的运动。毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)是在毛细管中实现电泳分离的技术。如图9.1所示，充满了电解质或缓冲液的水性介质的玻璃管的两端与装有相同缓冲液的容器连接在一起，并在这两个容器中插入连有高压电源的两个铂电极。假设有一个样品含有分子大小不同的中性分子和带电离子，而且带电的离子带有不同的电荷。将样品放置在玻璃管的正极端，在整个体系中加上电场，则样品中的离子就趋向于以不同的速度沿不同的方向在管内迁移。迁移的速度和方向取决于离子的尺寸和离子所带电荷的大小和符号。,3,图9.1 毛细管电泳示意图9.1.2区带电泳9.1.3引起区带扩散的因素9.1.4管的直径对对流扩散的影响9.1.5介质中的电泳9.1.6毛细管电泳,4,9.2毛细管电泳体系9.2.1概述 从概念上来讲，毛细管电泳体系比较简单。如图9.2所示，其主要组成有样品池、入口池、出口池、毛细管、检测器、高压电源、数字结果处理设备，如一台分析仪或一台计算机。图9.2 毛细管电泳体系的系统描述,5,图9.3 毛细管电泳图图9.4 常见的毛细管电泳进样方法,6,9.2.3源瓶与出口瓶 源瓶有时也称为入口池或入口瓶，终点瓶有时称为出口瓶或出口池。通常情况下，源瓶、毛细管和终点瓶装有同样的缓冲液。9.2.4毛细管图9.5 毛细管检测窗口9.2.5检测器 目前，多种检测器在毛细管电泳中已经得到了广泛的应用，包括：紫外/可见、荧光、激光诱导荧光、质谱、传导、放射和折射率。,7,9.2.6动力供应 所谓的动力供应是为了提供横穿毛细管的驱动力。大多数使用一恒定电场、恒定电流或恒定功率，并且有电场反向功能的模块。9.2.7数据处理9.3 毛细管电泳与其他分离技术的比较 高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)与毛细管电泳相似，在于这三种方法中数据表示、数据处理和自动化基本相同。Jorgenson曾经将毛细管电泳描述为“电泳的高效分离机理与色谱的设备和自动化概念的混合产物”。9.3.1效率9.3.2样品种类9.3.3进样体积9.3.4灵敏度9.3.5试剂要求,8,9.4毛细管电泳分离原理9.4.1电渗流 在CE中，除了溶质，缓冲液在电场的作用下也沿着毛细管迁移。这种现象被称之为电渗或电渗流(electroosmotic flow，EOF)。在正常模式中，电渗流的方向是由正极向着负极，缓冲液从入口池通过毛细管和检测器到达出口池。,图9.6 溶质通过毛细管的顺序,图9.7阳离子、中性分子、阴离子的电泳谱图,9,1)电渗流的作用2)电渗流的产生图9.8 电渗流的产生,10,图9.9 不同驱动力的流型和相应的谱带峰形3)电渗流的速度和迁移率(1)电场强度(2)缓冲液的pH值(3)缓冲液的浓度或离子强度,11,(4)温度(5)有机溶剂(6)毛细管壁的化学改性(7)在毛细管壁上施加径向电压(8)改变电渗流因素概括4)电渗流的测量5)电渗流的反向(1)为什么要使电渗流反向(2)怎样使电渗流反向6)电渗流对分辨率的影响9.4.2电泳迁移率1)电泳速度和迁移率的测量2)影响电泳迁移率的因素,12,(1)溶质的电荷(2)溶质大小9.4.3电泳参数对分离的影响 影响电泳分离的参数主要有时间、效率、选择性和分辨率。每个分离参数都受一个或多个电泳参数的影响，包括电压、电泳迁移率、电渗流和毛细管长度。1)时间2)效率3)选择性4)分辨率9.5毛细管电泳的分离模式9.5.1毛细管区带电泳(CZE),13,图9.10 CZE中不同组分的迁移示意图9.5.2胶束电动力毛细管电泳(MEKC)1)胶束电动毛细管色谱的原理图9.11 MEKC的分离原理示意图,14,图9.12 胶束电动色谱图2)MEKC中的保留参数3)MEKC中的分辨率4)用MEKC分离离子化溶质5)在MEKC中使用改性剂6)其他类型的电动色谱,15,9.5.3毛细管凝胶电泳(CGE)1)毛细管凝胶电泳原理2)交联聚丙烯酰胺凝胶3)线性聚丙烯酰胺凝胶4)改变电场用CGE分析DNA片段5)CGE中使用改性剂9.5.4毛细管等电聚焦(CIEF)1)毛细管等电聚焦原理 毛细管等电聚焦属于毛细管电泳中的一种聚焦技术类型，其溶质通常是蛋白质，分离基于蛋白质等电点(PI)的差异。毛细管内充满两性电解质和蛋白质溶液，加上一个电场，在毛细管中产生一个pH梯度。各种蛋白质因为它们的等电点不同，而在毛细管内聚焦为许多狭小的区带。毛细管内的溶液在动力作用下通过检测器而产生电泳图。,16,2)毛细管内形成pH梯度3)等电聚焦图9.13 CIEF分离机理示意图4)聚焦区带的活动化5)CIEF的应用9.5.5毛细管等速电泳(CITP)1)CITP的原理 CITP是一种置换色谱的电泳配对物。,17,图9.14 CITP分离机理示意图2)等速电泳图的外观图9.15 等速电泳谱图,18,3)柱上瞬时ITP浓缩4)双柱ITP预浓缩9.6毛细管电泳的仪器设备 毛细管电泳系统主要仪器组成部分有：高压电源、来源与目标缓冲液池、毛细管、检测器、以及数据处理设备诸如长条纸记录器、积分仪或计算机。来源与目标缓冲液体池，有时指的是入口与出口池或入口与出口接受器。9.6.1进样系统 在高效液相色谱和气相色谱中，样品通常靠一环形阀门进样器或注射器直接进入仪器形成流体或蒸气，而在毛细管电泳中，样品通常是被引入毛细管的。1)流体力学进样2)电动力进样,19,3)各种进样方法的比较图9.16 样品堆积效应示意图,20,4)场放大样品进样5)等速电泳对样品的浓缩6)其他进样方法9.6.2检测 毛细管电泳如同HPLC一样是经过分离的溶质能从盛有液体的管中洗脱出，因此，大多数能用于HPLC的检测器同样对毛细管电泳管用。1)紫外/可见吸光光度法检测2)间接紫外/可见吸光度法检测3)紫外/可见光度检测中提高灵敏度的方法4)荧光光度检测5)激光诱导荧光检测,21,图9.17 激光诱导荧光检测器光路示意图图9.18 利用鞘流池进行柱后,22,6)间接荧光检测7)化学发光法检测8)质谱法检测9)电化学检测(1)安培计检测(2)间接安培计检测(3)电导率检测10)其他检测模式9.6.3高电压动力供应 高电压动力供应的目的是为电泳提供所需的电压、电流或功率。尽管大多数毛细管电泳分离是靠固定电压模式来实现的，用固定电流和功率模式操作同样具有动力提供的能力。例如，毛细管等速电泳是靠固定电流模式来完成的。,23,9.6.4毛细管温度控制9.6.5毛细管9.7毛细管电色谱 毛细管电色谱技术(Capillary eletrochromatography,CEC)，是一种新的电分离技术。它也可看作是电泳(CE)和高效液相色谱(HPLC)的进一步结合。9.7.1毛细管电色谱的原理与分类1)原理2)毛细管电色谱的分类(1)按流动相的组成不同分为一般电色谱(流动相中含水溶液和电解质)和非水溶剂电色谱。(2)按固定相的实现方式不同可分为：填充柱电色谱和开管电色谱。,24,(3)按固定相种类不同可分为正相电色谱、反向电色谱、手性电色谱、离子交换电色谱等。9.7.2毛细管电色谱的操作模式及柱子的制备1)操作模式(1)电渗流驱动的电色谱：它可在现有的商品毛细管电泳仪上实现。(2)电渗流与泵双重驱动电色谱：其优点是将气泡冲出柱子或者使气体在高压下溶解，从而解决了CEC中的气泡问题。2)柱的制备(1)柱的填充拉制法匀浆法（压力法）电填充法制备无封口的填充柱,25,（）封口的制备9.7.3梯度毛细管电色谱9.7.4毛细管电色谱的应用9.7.5毛细管电色谱存在的问题及前景展望焦耳热效应塞子效应气泡问题,