纳米微粒生物传感器ph.ppt
荧光生物纳米传感器,彭 洪 尚北京交通大学,第十二届全国发光学术会议,于苏州,第十二届全国发光学术会议,生物传感器,荧光,纳米,生物分子 电解质离子 溶解气体 温度,signal,灵敏度高无损伤响应速度快二维平面成像,生物材料的大小：细胞：100-10 um 细胞器：10-1 um,活体线粒体中NADH的多光子成像。Karl Kasischke,et al.,Cornell University.,第十二届全国发光学术会议,测量细胞中Ca2+浓度。Tsien,R.Y.et al.Science 280,19541955(1998).,无内源荧光,有内源荧光,生物检测对象,直接测定,引入荧光探针,荧光分子易被细胞内某种细胞器封存，或与胞内成分发生非特异结合，造成荧光信号失真稳定性差，存在荧光漂白单一的荧光波长,受探针浓度分布、光电子系统的随机漂移影响为适应自由进出细胞膜，分子结构需特殊的功能化,第十二届全国发光学术会议,荧光探针分子,基质具有保护作用，防止了荧光分子与细胞内成分发生作用，同时提高了稳定性提高了荧光强度（大量荧光分子封装于一个颗粒中），即高信噪比；同时封装两种以上荧光分子，实现比率荧光传感多种成熟进入细胞方法：基因枪、皮量注射枪、细胞内吞作用,第十二届全国发光学术会议,胞内检测温度、pH的意义,认识细胞内的复杂的生理过程：细胞分裂、基因表达、新陈代谢等 疾病诊断：病态细胞温度高于正常细胞，酸化的pH值与组织缺氧以及等其他疾病态相关 肿瘤治疗：光热pH值与肿瘤细胞耐药性有关系,Part I.荧光温度纳米传感器,Hydrophilic Fluorescent Nanogel Thermometer for Intracellular Thermometry，C.Gota et al.，J.Am.Chem.Soc.2009,131,2766.,第十二届全国发光学术会议,Temperature-sensitive PolymerWater-sensitive Fluorophore,纳米温度传感器的横截面示意图。温度探针分子Eu-DT随机分布于纳米颗粒内部（由BTD-PMMA组成），纳米颗粒表面覆盖着完整（或间断的）二氧化硅薄层。,第十二届全国发光学术会议,Luminescent europium(III)nanoparticles for sensing and imaging of temperature in the physiological range.Peng Hongshang et al.,Adv.Mater.2010,22:716.,有机硅氧烷BTD：碱性环境下，硅氧烷基团迅速水解，以及硅醇缩聚，在纳米颗粒表面生成带负电二氧化硅薄层,聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）：减少温度探针的掺杂浓度，从而降低浓度猝灭以获得较强的发光和较长的荧光寿命。PMMA的折射率(1.49)与二氧化硅(1.46)匹配，这也使得生成的纳米颗粒拥有较好的光学透明度。,Eu-DT荧光特性：大的斯托克斯位移(200-300 nm)针状发射峰 5D0发射具有强的温度依赖特性 可见光激发,荧光温度探针分子铕-三（二萘甲酰甲烷)-二(三辛基氧化磷)（Eu-DT）,第十二届全国发光学术会议,第十二届全国发光学术会议,温度纳米传感器的制备及表征,再沉淀-封装方法制备纳米颗粒示意图,第十二届全国发光学术会议,Eu-DT掺杂浓度对纳米颗粒荧光强度和寿命的影响,根据温度敏感度的定义I/(IrefT),纳米颗粒在生理温度范围内（25-45 oC）的敏感度为-3.07%/oC。假设荧光强度测量的精确度为1%，那么Eu-DT纳米传感器的温度分辨率可以达到 0.3 oC。,荧光纳米传感器的温度依赖特性之荧光强度,25-45oC之间，荧光寿命温度敏感度为-2.2%/oC。,第十二届全国发光学术会议,荧光纳米传感器的温度依赖特性之荧光寿命,第十二届全国发光学术会议,基于Eu-DT纳米颗粒的生物温敏薄膜的荧光成像,Eu-DT纳米颗粒置入生物相容性薄膜聚乙烯醇中。不同温度、不同压力下的荧光寿命伪彩色成像。蓝色相应于最长寿命（400 s），红色对应于最短寿命（122 s）。,第十二届全国发光学术会议,Ratiometric fluorescent nanoparticles for sensing temperature,Peng Hongshang et al.,J.Nanopart.Res.2010,DOI:10.1007/s11051-010-0046-8.,第十二届全国发光学术会议,比率荧光纳米传感器的荧光强度的温度依赖特性,根据温度敏感度的定义，纳米颗粒的比率荧光强度在生理温度范围内（25-45 oC）的敏感度为-4%/oC,Part II.比率荧光pH纳米水凝胶,第十二届全国发光学术会议,第十二届全国发光学术会议,Honghao Sun，et al.,Chem.Mater.,2006,18(15),3381,比率荧光pH纳米传感器研究进展,Preston T.S.et al.,J.Am.Chem.Soc.,2006,128(41),13320,Hilderbrand S.A.et al.,Bioconjugate Chem.,2008,19(8),1635,纳米水凝胶的截面示意图及组成成分化学结构式。在聚亚胺酯水凝胶中，溴百里酚兰，香豆素6和尼罗红随机分布。,第十二届全国发光学术会议,Nanogel for Ratiometric Fluorescent Sensing of Physiological pH Values.Hongshang Peng et al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49:4246-4249.,聚亚胺酯（PU）：基质 溴百里酚兰（BTB）：pH指示剂，pKa=7.6 香豆素6（C6)：绿色荧光分子 尼罗红（NR）：红色荧光分子,第十二届全国发光学术会议,比率荧光pH纳米水凝胶的制备及表征,再沉淀法：将PU,BTB,C6 和NR按照一定比例溶于乙醇/水（9/1）的混合溶液中，然后于水中透析24小时，经200nm的膜过滤，即得到水凝胶分散液,纳米水凝胶在水溶液中的粒径分布,比率荧光纳米水凝胶的pH传感机理,第十二届全国发光学术会议,比率荧光纳米水凝胶的pH响应特性,第十二届全国发光学术会议,比率荧光纳米水凝胶的pH校正曲线。实验数据由620nm 和500nm处的荧光强度比计算得到，拟合方程为,450 nm激发下，荧光纳米水凝胶在不同pH值（4.92,5.29,5.91,6.24,6.47,6.64,6.81,6.98,7.38,7.73,8.04,8.34,8.67,and 9.18）下的荧光发射光谱,BTB的离解平衡式可以表示为：可相应得到BTB 的解离常数Ka为假定纳米水凝胶中荧光分子的荧光强度服从Beer-Lambert定律：纳米水凝胶的荧光强度比率NR(620 nm)/C6(500 nm)可以写为通过常数设定，最后简化为下式,第十二届全国发光学术会议,纳米水凝胶pH荧光响应性的理论推导,在505 nm和620 nm处的荧光强度变化分别为+8%和-8%，说明微量荧光分子的泄露。,第十二届全国发光学术会议,比率荧光纳米水凝胶的稳定性,C,A,B,负载纳米水凝胶的小老鼠正常肾上皮细胞（pH 7.4）的荧光显微照片：绿色通道（A）、红色通道（B）以及混合通道（C）。图中标尺为20微米。利用干涉滤光片，C6用470 nm光激发，收集525 nm发射光。NR用 545 nm光激发，收集605 nm的发光。,第十二届全国发光学术会议,活体细胞内纳米水凝胶的荧光成像,Thanks for your attention！,第十二届全国发光学术会议,
