秋季福建-04毛细管电泳法.ppt

1,毛细管电泳法Capillary Electrophoresis,2,经典电泳最大局限性在于难以克服由于高电压引起的焦耳热。,Slab Gel Electrophoresis,heat,3,第一节 概 述,一、毛细管电泳的沿革1967年，瑞典科学家Hjerten CZE1970年，Everaerts 毛细管等速电泳，但效果不足以引人关注1974年，Virtanen 细毛细管;1979年,Mikkers等证实;CZE 第一个重大突破1981年，Jorgenson等 75微米内径毛细管 CZE 4105/m1983年，Hjerten提出了毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦法1984年，Terabe发展了胶束电动毛细管色谱（MECC）1986年，Lauer 蛋白质在CZE中的分离效率 106/m,4,News Focus,SCIENCE 291/5507,1207B,2001,毛细管电泳技术平台对人类基因组计划的重要性 96道毛细管电泳快速测序,5,Automated Sequencing,6,DNA序列分析中所用的四种荧光衍生试剂,Nature 1986,327:674,7,8,二、毛细管发展新动向,方法发展方面：阵列毛细管电泳、芯片毛细管电泳、亲和毛细管电泳等发展联用技术：CE-LIF、CE-MS、CE-NMR 等应用方面：DNA测序、蛋白质分析、单细胞分析、手性分离、糖分析等,9,CAECapillary Array Electrophoresis,CCEChip CapillaryElectrophoresis,阵列毛细管电泳,芯片式毛细管电泳,10,三、基本特点,Capillary i.d.25-100 m o.d.375 m,聚酰亚胺涂层,熔融石英玻璃,比表面积大 散热快高电压柱效高,11,优 点高效 理论塔板数105106/m，CGE107/m快速 几十秒至十几分钟微量 进样体积小到1L，消耗体积1-50nL样品 无机离子到整个细胞 经济 消耗几毫升缓冲溶液,高效、快速、低耗、应用广泛,12,缺 点制备能力差光路短，高灵敏度的检测器填充管需要专门的灌柱技术大的侧面/截面积比，放大吸附作用吸附引起电渗变化，影响分离重现性,13,毛细管电泳(CE)又称为高效毛细管电泳(HPCE)，是一类以毛细管为分离通道、以高压电直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。,第二节 基本理论,分离依据：组分沿管轴方向运动的速度差异,14,电泳(electrophoresis)：也叫电迁移(electromigration)，指在电场作用下带电粒子在缓冲溶液中的定向移动。电泳技术：将电泳应用于物质的分离，就形成了电泳技术或方法。,_,一、电泳和电泳淌度,15,16,电泳为带电粒子在电场作用下在缓冲溶液中的定向移动。uep=ep E uep：移动速度；E：电场强度；ep：溶质的电泳淌度（单位电场强度下的移动速度）,17,ep可近似地表达为：是介电常数，是介质的粘度，i是粒子的Zeta电位。,18,I Z/M2/3i：Zeta电位 Z：表面电荷 M：摩尔质量 荷电粒子在电场作用下，依据表面电荷密度的差别，进行差速移动而实现电泳分离，这就是在自由溶液区带电泳中不同荷电粒子的分离基础。,19,有效淌度(effective mobility),实际溶液中，荷电粒子的活度系数、溶质分子的解离程度均对荷电粒子的电泳淌度产生影响，此时正确的淌度值应示为有效淌度。有效淌度ef：ef I iiep式中I为样品分子的第i级解离度，i为活度系数或其他解离常数。,20,?,21,二、电渗和电渗率（电渗淌度）,电渗是一种液体相对于带电管壁移动的现象电渗的产生与双电层有关。,pI=1.5 pI2 管壁带负电,液-固界面上，固体分子会解离形成离子，表面的离子通过静电力又会吸附溶液中相反电荷的离子从而形成双电层。,22,双电层中处于扩散层中的阳离子在毛细管内壁负离子表面形成一个圆筒形的阳离子塞流，而阳离子又是溶剂化的，在外加电场作用下，水化阳离子携带溶剂一齐向阴极迁移，形成电渗流。,电渗流 Electroosmotic flow,EOF,23,电渗淌度os：也称电渗率，即单位电场下的电渗速度 os=uos/E 电渗淌度os可用下式表示，即：,一般地，电渗流速度是电泳流速度的5-7倍，其中石英毛细管中电渗流-流向阴极。,溶液介电常数,管壁电动势,粘度,24,25,电渗流的特点,电渗流使几乎所有的样品组分向同一方向移动电渗流具平面流型改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速电渗流的微小变化影响结果的重现性（在HPCE中，控制EOF非常重要！）,26,影响电渗流的因素,电场强度缓冲液pH离子强度或缓冲液浓度温度有机改变剂表面活性剂共价涂渍,27,电渗流的影响因素及其控制,1.电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同。,28,29,4.温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”（毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量）HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1度，将引起背景电解质溶液黏度变化2%3%。,30,5.添加剂的影响,（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。,（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。,31,三、表观淌度,表观淌度(apparent mobility)在不考虑相互作用的前提下，离子的电泳淌度和溶液的电渗淌度的矢量和 uap=uef+uos=(ef+os)Eap=ef+os uap为表观迁移速度，ap为表观淌度,32,迁移速度：正离子中性分子负离子,33,ueo=L/tos,电渗流速度的实验计算,34,What would be the order of elution between?Small cations(mono/highly charged)Small anions(mono/highly charged)Large cations(mono/highly charged)Large anions(mono/highly charged)Neutral molecules,35,电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）,36,四、分离效率和峰加宽因素,(一)分离效率 毛细管柱效 也用塔板高度H和塔板数n表示 n可以利用峰参数直接测定:n=5.54(tm/W1/2)2 n=Ld/H Ld为进样口至检测器的距离 tm 为流出曲线最高点所对应的时间，称为迁移时间(migration time)。,37,毛细管总长度与有效长度,迁移时间：样品组分从进样口迁移到检测窗所需要的时间,38,(二)峰加宽因素,毛细管电泳区带加宽来自于进样、分离、检测过程。进样加宽：2=2/12 进样区带长度检测加宽：取决于系统电子线路的相应时间 对于CZE来说，分离过程的加宽因素包括纵向扩散、焦耳热、吸附等因素。对于MECC来说，除上述因素外还包括由胶束相和水相动力学分配平衡所造成的加宽。,39,1.纵向扩散,纵向扩散加宽-由溶质的扩散系数和迁移时间两项决定2=2Dtm 分子量越大，扩散系数越小，纵向扩散减小；迁移时间越长，扩散几率越大；迁移时间受电压、毛细管长度、缓冲溶液的浓度影响。,40,2.焦耳热（Joule heating）,焦耳热通过管壁向环境扩散 靠近管壁温度低，靠近中心温度高，形成温度径向梯度 温度引起缓冲液径向粘度梯度 引起离子迁移不均匀，破坏扁平流，导致区带变宽 焦耳热会引起电泳分离介质的温度梯度、黏度梯度、速度梯度，从而引起区带展宽。焦耳热大小取决于操作功率的大小，与毛细管尺寸、缓冲液电导及电场强度有关。用物理方法直接降温或恒温,41,3.吸附,在毛细管电泳中，吸附是指毛细管管壁对被分离物质粒子的作用。吸附原因：静电作用、疏水作用通常被分离物质分子越大，吸附越严重。蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。,42,五、分离度,影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。,分离度可按谱图直接由下式计算：或,43,第三节 毛细管电泳的主要分离模式,一、毛细管电泳的分类按分离通道形状：分为圆形、扁形、方形毛细管电泳等等；按操作方式：可分为手动、半自动、全自动毛细管电泳；按毛细管中填充物质的状态：可分为自由溶液和非自由溶液毛细管电泳；按分离机制分可以分为：电泳型、色谱型、电泳色谱型,44,单根毛细管电泳类型,按照分离模式分类毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis)胶束电动毛细管色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography)毛细管等电聚焦电泳(Capillary Isoelectric Focusing)毛细管等速电泳(Capillary Isotachrophoresis)毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis)毛细管无胶筛分(Capillary Non-gel Sieving)毛细管电色谱(Capillary Electric Chromatography)毛细管亲和电泳(Capillary Affinity Electrophoresis),46,毛细管区带电泳Capillary zone electrophrosis(CZE),毛细管区带电泳(CZE)是毛细管电泳中使用最为广泛的一种技术。它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下迁移速度的不同而进行分离的。,47,毛细管区带电泳分离,48,(一)操作电压,在柱长确定时，随着操作电压的增加，粒子的总迁移速度加快，纵向扩散减小，柱效增大。概而言之，在一定的范围内柱效随电压的最大而增大；过了极点以后，随着电压的增高，焦耳热的影响加剧，柱效反而下降。,毛细管电泳分离柱效方程：,49,(二)缓冲液种类选择,缓冲液的选择通常须遵循下述要求：1.在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量。2.在检测波长处的吸收低。3.自身淌度低，即分子大而荷电小，以减少电流的产生。生物学上所谓的理想缓冲液(如Tris,硼酸盐等)，特别有用，因为它们的离子质量都很大，可采用高浓度而不产生电流。,50,（三）缓冲液的pH值,影响溶质的状态缓冲液pH低于溶质pI，溶质带正电缓冲液pH高于溶质pI，溶质带负电酸性组分在碱性条件下分离，碱性组分在酸性条件下分离，两性物质选择pH高于或低于pI1到2个单位影响电渗率pH值增大，电渗率增大,51,缓冲液pH值对不同材料毛细管内电渗的影响,52,(四)缓冲液的浓度,缓冲试剂的浓度一般控制在10-200mmol/L。电导率高的缓冲试剂，其浓度多控制在20mmol/L附近；导率低的缓冲试剂，其浓度多控制在100mmol/L以上。为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高的试剂浓度(0.5 mol/L)。,53,缓冲液浓度对电泳分离的影响,54,(五)添加剂的影响,有三类重要的添加剂：荷电表面活性剂，非电解质高分子添加剂，功能性添加剂,牛血清白蛋白多肽的CZE快速鉴定,55,56,57,胶束电动毛细管色谱（MECC）分离示意图,58,59,毛细管电色谱（CEC）,60,Non-aqueous capillary electrophresis(NACE),非水毛细管电泳是在有机溶剂为主要的非水体系中进行的毛细管电泳有机溶剂中要加入电解质非水溶液中直接测得的pH值称为表观pH值，与水溶液中的pH概念不同，即便表观pH与水中一样，解离常数也会有很大的差别,61,示例：虎杖药材NACE指纹图谱研究,虎杖为廖科植物虎杖的干燥根茎和根，用药历史悠久，具有祛风利湿，散瘀定痛，止咳化痰之功效，传统忧郁关节痹痛，湿热黄疸等。主要活性成分是蒽醌和二苯乙烯苷类。药典对大黄素和虎杖苷进行含量测定。大黄素C18，甲醇0.1磷酸水(80:20)虎杖苷C18，乙腈水(23:77)非水毛细管电泳增加了分离分析的选择性，减少了毛细管内壁的吸附改善分离，提高分离灵敏度。,知母及虎杖药材色谱指纹图谱研究，黄晟，第二军医大学硕士论文，2004,1虎杖苷2大黄素甲醚3大黄素S内标厚朴酚,对照品,供式品,前处理：虎杖中蒽醌类成分不溶于水，可溶于甲醇和乙酸乙酯，因此用甲醇和乙酸乙酯为提取溶剂考察溶剂及超声提取的时间甲醇超声提取60分钟波长选择：虎杖苷、大黄素、大黄素甲醚、厚朴酚225nm,知母及虎杖药材色谱指纹图谱研究，黄晟，第二军医大学硕士论文，2004,背景电解质溶液：溶解度与分离选择性甲醇:水 1:1波长选择：虎杖苷、大黄素、大黄素甲醚、厚朴酚225nm,知母及虎杖药材色谱指纹图谱研究，黄晟，第二军医大学硕士论文，2004,虎杖药材60分钟电泳图,虎杖对照药材电泳叠加图,确认有12个吸收峰为共有峰，通过紫外吸收光谱和对照溶液添加法确定1虎杖苷，2大黄素甲醚，7大黄素。以参照物厚朴酚的保留时间和峰面积为1，计算相对保留时间和相对峰面积。提取对照药材的共有模式作为虎杖样品的对照指纹图谱。,知母及虎杖药材色谱指纹图谱研究，黄晟，第二军医大学硕士论文，2004,知母及虎杖药材色谱指纹图谱研究，黄晟，第二军医大学硕士论文，2004,67,汉中的虎杖样品的指纹图谱与对照图谱相似性最好，其次是贵阳虎杖，安徽金寨虎杖相似度最低。,知母及虎杖药材色谱指纹图谱研究，黄晟，第二军医大学硕士论文，2004,68,第四节 毛细管电泳仪,69,一、毛细管电泳系统的基本结构,70,二、进样系统,电动进样、压力进样、扩散进样,+,-,电动进样,进样量 Qin=r2c0(ef+os)E,优点：普适方法 可完全实现自动化缺点：存在歧视效应,71,压力进样,进口端加压,出口端减压,虹吸作用,优点：无组分歧视效应缺点：选择性差,73,扩散进样,毛细管插入样品溶液，管口界面存在浓度差，样品分子向管内扩散，将样品引入毛细管中。进样量 Qin=400c0S(2D)1/2普适性进样方法 无歧视效应,74,三、温度控制,风冷控温液冷控温商品仪器常用氟代烷烃作冷却剂,75,四、检测系统,紫外检测器柱上检测：简单方便柱后检测：适合于CEC、CGE等采用填充灌的分离模式激光诱导荧光由激光器、光路系统、检测池和光电转换器件等部分组成。也分为柱上检测和柱后检测质谱检测器柱后检测 已经显示出极其广泛的应用前景,76,类型 检测限/mol 特点紫外-可见 10-1310-15 加二极管阵列，光谱信息荧光 10-1510-17 灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高，样品需衍生电导 10-1810-19 离子灵敏，需专用装置,77,毛细管电泳紫外检测,刀片刮除法火焰灼烧,检测窗口,2-3 mm,利用球镜聚焦增强紫外检测灵敏度,78,线性扫描激光诱导荧光检测器,由激光器、光路系统、检测池和光电转换器件等部分组成,79,CCD,lens,filter,laser,filter,lens,Micro-chip,80,线性激光诱导荧光检测器,81,82,83,84,高效毛细管电泳与高效液相色谱的比较,85,Separation and determination of coumarins in Fructus cnidii extracts by pressurized capillary electrochromatography using a packed column with a monolithic outlet fritJournal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 50(2009)695702,蛇床子为伞形科蛇床属植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cusson 的果实。蛇床子广泛分布于我国大部分地区，因地理位置和生态环境的不同，其种内的化学成分发生了较大的变异。,86,六个香豆素化学结构图（1）佛手柑内酯（2）蛇床子素（3）欧前胡素（4）欧山芹素（5）2-乙酰白芷素（6）O-乙酰哥伦比亚内酯。,87,通过在毛细管填充柱或内涂层柱两端施加直流高压电场，使样品在毛细管柱中的保留行为同时受到电泳及其在流动相与固定相之间分配系数的影响，在双重分离机制的作用下，毛细管电色谱对于被分离样品细微之处的分辨能力得到了极大的加强,毛细管电色谱原理,88,电色谱（CEC）作为一种新的微分离技术，结合了毛细管电泳技术的高柱效和高效液相色谱（HPLC）的高选择性的特点。缺点：来源于由毛细管色谱填充柱带来的气泡和柱干燥问题。,加压毛细管电色谱（pCEC）结合了EOF和外加压力的优点 增加了峰容量 缩短分析时间 抑制了气泡的产生,89,色谱柱是pCEC 分析中的关键，而同时能用于HPLC的反相C18填料的填充柱是pCEC 中较常用的色谱柱。常规的填充柱在柱子两端烧结塞子以固定填料，烧塞不好将导致在使用中易产生一系列问题：塞子的重现性不好柱子在烧塞处易折断烧塞处峰扩展和易形成气泡等本文在pCEC系统上使用一种改进后的电色谱填充柱，它的出口端用一段整体柱作为塞子代替传统烧结的塞子而进口端则为无塞子的开口端。,90,加压毛细管电色谱仪搭建,91,出口端整体柱制备,聚合液,冰浴超声震荡5 min,0.3 mL GMA 1.1 mL 环己醇+0.1 mL 十二醇4 mg AIBN 0.1mL EDMA,聚合液,充分溶解后,氮气除氧3 min后,约20cm,50 恒温水浴箱内反应12 h,甲醇,水,除去致孔剂、残留的反应试剂、反应产生的低聚合度物质及其他可溶性化合物,92,毛细管色谱柱的填充,采用电渗法将填料混悬液充入,约2mm作为塞子,烧去聚亚酰胺层作为窗口,已制备好的整体柱端,空口端,93,自制毛细管色谱填充柱示意图,进口,填充柱,塞子,检测窗,出口,94,样品溶液及标准品溶液的配制,精密称取佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、欧山芹素、2-乙酰白芷素和O-乙酰哥伦比亚内酯及内标安定一定量，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，定容成佛手柑内酯和2-乙酰白芷素1 mg/mL，欧前胡素、O-乙酰哥伦比亚内酯和欧山芹素2 mg/mL，蛇床子素4 mg/mL和安定1 mg/mL的标准储备液。所有溶液在使用前均需超声脱气。约1 g碾成粉末的蛇床子药材，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，精密加入95%乙醇 20 mL,密塞，摇匀，超声处理1 h，避光放置24 h，精密吸取2.5 mL 置10 mL量瓶中，加1 mg/mL的内标溶液1 mL，加流动相定容至刻度，经0.45 m滤膜滤过后，取续滤液作为供试品溶液。,95,优化后的分离条件色谱图,六种香豆素对照品的加压毛细管电色谱图。流动相：乙腈-10 mM醋酸铵水溶液（用醋酸调节pH至4.0）（体积比为50：50）；进样量：40 nL；分离电压-6 kV；流速0.05 mL/min；反压1500 psi；紫外检测波长320 nm。样品：混合标准溶液。（1）佛手柑内酯，（2）欧前胡素，（3）蛇床子素，（4）2-乙酰白芷素，（5）欧山芹素，（6）O-乙酰哥伦比亚内酯。,96,影响因素考察乙腈比例,97,影响因素考察缓冲盐浓度及pH,醋酸铵缓冲液浓度（5，10，15 mM）分离度和分离时间轻微增加 10 mM 气泡产生pH值3.0至5.0（3.0，4.0，4.5，5.0）主要体现在改变EOF的作用上 六个香豆素的保留时间基本呈同一个水平 随着pH值的增加六个香豆素的分离有轻微的损失,98,影响因素考察运行电压,10kv8kv6kv4kv2kv,99,自制新型色谱柱的柱效,运行5次，20次，40次的加压毛细管电色谱图。样品：蛇床子药材提取液（产地：浙江临安）。流动相：乙腈-10 mM醋酸铵水溶液（用醋酸调节pH至4.0）（体积比为50:50）；进样量：40 nL；分离电压-6 kV；反压：1500 psi；流速0.05 mL/min；反压1500 psi；紫外检测波长320 nm。（1）佛手柑内酯，（2）欧前胡素，（3）蛇床子素。,自制新型色谱柱的柱效,101,线性范围、LOD和LOQ,102,精密度试验,103,回收率试验,104,不同来源蛇床子药材的含量测定,105,不同来源蛇床子药材的含量测定,流动相：乙腈-10 mM醋酸铵水溶液（用醋酸调节pH至4.0）（体积比为50：50）；进样量：40 nL；分离电压-6 kV；反压：1500 psi；流速0.05 mL/min；反压1500 psi；紫外检测波长320 nm。（1）佛手柑内酯（2）欧前胡素（3）蛇床子素（4）2-乙酰白芷素（5）欧山芹素（6）O-乙酰哥伦比亚内酯,12批不同来源蛇床子药材中香豆素类化合物的加压毛细管电色谱图,106,RP-HPLC,107,细径柱RP-HPLC,MECC,