毛细管电色谱的方法原理与应用.ppt
加压毛细管电色谱仪的原理及应用 Capillary ElectrochromatographyAdvances and Applications,CEC基本原理,1微型分离技术2micro-HPLC 和 CE的结合3电渗流(EOF)为流动向的推动力4二维分离机理：液相色谱和电泳之和（分配和电泳淌度）,历史回顾和研究现状,一、毛细管电色谱发展进程1952年Mould 和Synge2首次在色谱分析上使用了电渗流，他们在薄层色谱上利用电场分离了胶棉中的多糖化合物。1974年Pretorius3才首次成功地实现了在填充毛细管液相色谱中用电渗流取代泵，并获得了比传统液相色谱高的柱效能，但是由于Pretorius当时所用的柱子管径较大，因此CEC的优越性没有得到充分展示，所以在70年代后期，此法没有得到充分重视。直到1980年Otsuka4才又发表了一篇有关CEC的文章。1981年Jorgenson等5用CEC分离了两种毛细管区带电泳难以分离的电中性芳香化合物后，逐渐引起人们的重视，关于CEC的文章陆续得到了报道。1987年特别是在Knox6,7从理论上阐述了CEC高效性的特点以后，毛细管电色谱才真正的得到了飞速发展并成为一个新的研究方向。,毛细管电色谱研究进展,2 Mould,D,L,.Analyst.1952,77:963-9683 Pretorius.V,et al.J.Chromatogr.,1974,99:23-304 Otsuka.S,et al.Anal.Biochem.,1980,102:419-4225 Jorgenson,J,W,et al.J.Chromatogr.,1981,218:209-2166 Knox.J,H,et al.Chromatographia,1987,24:135-1437 Knox.J,H.Chromatographia,1988,26:329-337,历史回顾和研究现状,二、毛细管电色谱基本原理CEC与HPLC原理的比较CEC：是采用具有塞状流型的电渗流推动流动相，其线速度是与柱的直径和填料颗粒大小无关的。因而在毛细管中几乎没有流速梯度，谱带展宽效应很小。HPLC：是采用压力驱动流动相，流速随填料颗粒大小和柱长而变化，流速在管中呈抛物线状轮廓，因而造成谱带展宽和柱效的降低。,毛细管电色谱研究进展,8Momika M.Dittmann Gerard P.Rozing.Journal of Chromatography A,744(1996)63-74.,历史回顾和研究现状,二、毛细管电色谱基本原理CEC的保留机理8,9如同HPLC：基于溶质在固定相和流动相间相互作用的不同。如同CZE：基于溶质电泳淌度的不同。KKk(ep/eof)+(ep/eof)（1）K是CEC的容量因子 K是在CEC中单纯色谱因素引起的容量因子 ep为溶质的电泳淌度 eof 为流动相的电渗淌度讨论：（1）对于中性化合物，ep 为零，K等于K反应纯粹的色谱过程（2）对于不保留的带电化合物，K为零反应纯粹的电泳过程（3）对于有保留的带电化合物，色谱和电泳机理同时起作用，因此CEC既能分离电中性物质，又能分离带电物质。,毛细管电色谱研究进展,9 Colon,L,A,Guo Y,Fermier,A.Anal Chem,1997,69(15):46110 Rathore,A,S,Horvath,C.J Chromatogr,1996,743:231,CEC 的保留机制：,CEC=HPLC+CE,依靠电渗流(EOF)或电渗流结合压力流推动流动相，使中性和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间吸附、分配平衡常数的不同和电泳速率不同而达到分离分析；CEC的理论塔板数远远高于HPLC；既能分离带电物质，也能分离中性物质；,Fig.3.CEC combines the strengths of two powerful analytical techniques CE and HPLC,历史回顾和研究现状,三、毛细管电色谱的操作模式用电渗流驱动的电色谱 由于仪器结构简单，应用面比较广。用电渗流和泵双重驱动的电色谱 优点：避免在分离过程中气泡的产生，同时可以用泵来控制 流速，缩短分离时间。,毛细管电色谱研究进展,CEC的优势：,减小谱带展宽,图5.不同分离模式下的谱带展宽,图4.电驱动和压力驱动下的流形比较,CEC的优势：,柱效,CEC：104105 plates/m HPLC：103104 plates/m,理论塔板数,Fig.6.the rapid and high-efficiency separation of PAHs with CEC-LIF,CEC的优势：,快速,Fig.7.Electrochromatogram showing the CEC separation of 16 PAHs within 2.5 minutes,存在的问题：,在传统的CEC模式中，由于焦耳热效应，常常会遇到气泡和“柱内干涸”等问题；气泡的出现会导致基线不稳、重现性不好、电渗流的中断等现象；在传统的CEC系统中加入一个u-HPLC泵，依靠电渗流结合压力流的模式来驱动流动相的一种新技术，就是熟悉的加压毛细管电色谱（pressurized capillary electrochromatography，简称pCEC)pCEC(1)改变泵压可有效地调节样品中各组分的保留，提高分离度；(2)有效地缩短样品的分析时间；(3)减少流动相和毛细管中气泡生成的可能性；(4)易于实现梯度洗脱；,目前，pCEC研究的热点：CEC理论的研究；仪器联用技术的发展；梯度洗脱技术；毛细管柱的制备（填充柱或整体柱）；芯片技术；应用领域拓展（环境分析，食品分析，生化分析等）；,历史回顾和研究现状,四、毛细管电色谱研究热点和难点热点：电色谱理论的研究和完善柱制备技术的研发 填充式、开管式和整体柱式应用领域的拓宽 环境领域、医药和生化领域手性拆分难点：柱制备技术焦耳热效应塞子效应气泡问题,毛细管电色谱研究进展,用途:分析生物活性肽中草药多糖等的成分分析.建立中草药的指纹图谱.药品的质量监控.结合高电压系统可提高分析效率.并使图谱更清晰明了.,图形分析:黑色代表普通HPLC的血清肽图谱.粉色代表加-10KV电压后血清肽图谱.黄色代表加+20KV电压后血清肽图谱.说明分析:加负电压后血清肽的出峰时间向后延迟,加正电压后出峰时间向前平移.表明血清肽合流动相后显负电性.样本在淌度和电压共同作用下谱图有变化.可以发现更多成分.同时提高分离效率.因为同一成分在流动相相同的情况下只是淌度不同.现在加了高电压.使以前需很长时间才能出现的峰现在只需很短时间就可出现.,黑色代表普通HPLC的脾肽图谱.蓝色代表加-5KV电压后脾肽图谱.粉色代表加-10KV电压后脾肽图谱.黄色代表加-15KV电压后脾肽图谱.,出峰时间从5.6分提前到了3.4分.效率几乎底稿50%.而且各主要成分均完美再现.没有漏掉主要的峰.,TriSepTM-2100加压毛细管电色谱仪操作流程,准备工作：样品：过滤（0.45或0.22m滤膜）流动相：过滤（0.45或0.22m滤膜），脱气,(注意：超声脱气时，水太热了要换),仪器,主要包括四个模块：流体输送单元（Solvent Delivery Module）；微流控制单元（Micro Flow Control Module）；高压电源（High Voltage Module）；检测器（Detection Module）和数据采集软件。各部分分别开关、设置工作参数和程序。使用温度10-35，相对湿度不大于75%。可以进行毛细管微柱色谱、毛细管电色谱、加压毛细管电色谱、毛细管电泳分析。,各单元参数设置及操作,1溶剂输送单元11 参数设置：反复按 FUNC/BACK 键至显示所要设置的参数，按数字键输入后，ENTER 确认；设置下一参数，主要参数设置完成，按CE 回到初始画面。常用参数包括流速FLOW（mL/min,如果在这个流速范围内进样量太大，就增加流速；反之就减小流速）、最高、最低限压P.MAX/P.MIN等（最低限压建议设置大于0的数值，否则漏夜、进气保护功能不能发挥作用）,12 输液方式,121 单泵恒比例送液：使用两个溶剂输送单元中的一个，按比例配好流动相并超声脱气，设置流速，按PUMP开始输液122 双泵恒比例送液：一种方式是分别在两个溶剂输送单元上分别设置流速，输送需要混合的A、B两种溶剂；另一种方法是设置主泵和从泵：FUNC/BACK 滚动至SYS 项，将主泵设为2，（从泵此项为1），此时主泵面板上的G.E.灯亮，在主泵面板上设置两种溶剂的比例CONC和总流速FLOW后，按主泵PUMP开始送液（注意，辅泵的流速是总流速乘梯度的比例后的值，此值最好不要小于0.005mL/min,否则辅泵流速不稳，影响梯度基线）,123 编辑梯度送液程序：在主泵上设置流速FLOW、基本输液比例CONC，编辑时间程序：EDIT 进入编辑状态，输入时间数值，滚动FUNC/BACK 到BCNC输入B相的梯度比例数值，按ENTER确认。常用的参数如BCNC（A、B液比例）、FLOW（流速）、STOP（停止程序）等。程序编好后，反复按ENTER查看，按DEL清除错误的程序步。按主泵RUN键运行时间程序,关掉RUN键，泵按梯度初始化条件走。,确认各溶剂系统互溶、缓冲溶液中溶质不会析出结晶！,13 系统排气或快速更换溶剂系统 把泵的吸滤头放进已经过滤并除气后的流动相中，加电时出口缓冲瓶中也装满相同的缓冲溶液。将Drain阀向OPEN方向（逆时针）旋转180度，按Purge键，约3分钟后自动停止，也可自己调整Purge 时间，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止。Close Drain阀。把流速调成1ml/min，把四通处连接反压阀的peek螺丝松开，十分钟后再把流速调成0.05ml/min,把反压阀的peek螺丝拧紧。,2紫外-可见检测器开启电源后，经过短暂的时间，氘灯点亮，波长显示为254 nm。(不一定是254nm，而是上次关机时使用的波长)，按FUNC/BACK键到改波长处，输入实验需要的波长值，ENTER确认，检测器一般30-60min的预热，然后按ZERO基线调零后，基线稳定后，可以进样。,注意：开色谱软件前要把微流控单元的开关打开。否则软件打不开。,3高压电源输出电压：0-30kV；电流：0-100A；最大功率：1W注意：当设置10kV以上电压时，应设置较长升压时间（如10秒），突然升压可导致破坏性后果；当环境潮湿时，不要设置超过10kV的电压。31 开机后，按MENU，以上下箭头选择分析模式：电色谱或电泳，ENTER确认,32 以上下左右箭头输入电压（最小单位100V）、升压时间和电场方向/，ENTER确认。确认检测器和微流控制单元仓门关闭、背板电缆连接正确，按RUN 执行注意，改变电压输出极性时，还要改变后面板高压线的插孔位置，设置输出为正电压时，后面板高压线插在“HV+”孔，设置输出为负电压时，后面板高压线插在“HV-”孔，地线始终接在“HV0”孔不变；设置好输出电压极性，按ENTER键 确定,33 模式下，还需输入电动进样的电压和时间。把进样条件和运行电泳的条件设好后，首先运行一下RUN，按RESET键断电后按INJECT，系统执行进样设置，完成后电压降至0。（每次改条件后都要先运行一下RUN后才能进样）34 RESET键：进样、升压时按下，电压降至0；分析完成，按此键退至上级菜单。,装柱：,1.装柱前首先把毛细管检测窗口和检测池装检测窗口的位置都用分析纯的乙醇擦干净，等乙醇挥发完后，可以装柱。（注意不要用口吹干）2.把柱子的检测窗口对准检测池的小球，对着光看，是透光的说明位置正好3固定柱子的PEEK螺丝的PEEK管要插到底部固定螺丝，否则毛细管装好后还会移动。4然后盖上盖子，按对角顺序上四个螺丝并固定住。（注意不要一次性拧紧一个螺丝）5螺丝固定后，把出口端的毛细管插到PEEK管里，把池子安装到检测器上，6打开检测器，自检结束后，按FUNC/BACK 滚动至看Sample和reference 值是否正常，如果sample值太小，说明柱子没装好。7卸柱子时，一定要把柱子出口端的毛细管从PEEK管里拔出，是毛细管柱子处于自由状态后才卸四个螺丝。否则容易把柱子折断。,分析样品,1确认各部分正确连接，开启电源，启动数据采集软件UnimicroTriSep Workstation。设置参数及程序，平衡色谱柱2设置工作站信号采集时间等，工作站工具栏绿色示意灯状态，准备采集信号3当进样控制面板的LOAD灯亮时，用微量进样器进样，此时，样品被注入到进样阀的定量环中，定量环的体积是固定的2 l（本系统中见入毛细管柱内的样品量通常是10 L或20 L），与实际进样量无关，多余的样品会流到样品废液瓶中。但应注意，由于在进样孔与进样阀之间存在一个连接管，其体积约10 L，因此，每当进一个新的样品时，第一次进样的进样量要大于40 L，以确保样品置换了进样管路里所有的溶液到达进样阀的定量环，以后每次进样，进样量只须5L即可。要将样品注入色谱柱中时，按进样控制面板上的按键，经过约1 s后，INJECT灯亮，表示样品池已被连入流路系统，样品开始进入色谱柱。当INJECT灯亮时系统自动开始采集数据。同时需按下主泵RUN键开始梯度程序、高压电源RUN 启动高压电场。,4分析结束，存储色谱数据，RESET停止高压。5清洗色谱柱、仪器管路、进样针，进样口；关闭各部分电源；填写使用记录。,
