实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.ppt
实 验 二,大肠杆菌感受态细胞的 制备及转化,内容一：大肠杆菌感受态细胞的制备,实验目的,实验原理,实验仪器、材料、试剂,实验步骤,1,2,3,4,注意事项,思考题,5,6,实 验 目 的,掌握感受态细胞的概念及其意义。掌握感受态细胞的制备原理与操作方法。,实 验 原 理,感受态：受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。制备感受态的细胞一般选择对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。常用的感受态制备方法包括KCl、CaCl2等方法；后者因为操作简便且符合大多数的分子克隆要求，因而被广泛采用。,CaCl2 法的基本原理：细菌处于低温（0）和低渗的CaCl2溶液中，菌体膨胀，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42进行短时间的热激处理，促进DNA的吸收。,实 验 原 理,CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。制备出的感受态细胞暂时不用时，加入占总体积15的无菌甘油于-70，可以保存半年。,实 验 原 理,提高转化效率要考虑几个重要因素：,实 验 原 理,1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4的培养菌，最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5107 个/ml左右。,2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的超螺旋态DNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。,实 验 原 理,3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，并用微孔滤膜过滤灭菌，最好分装保存于干燥的冷暗处。,实 验 原 理,4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。,实 验 原 理,实验仪器、材料、试剂,1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式 离心机、无菌操作台、微量移液 器、恒温摇床；2、材料：菌种E.coli DH5；3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。,1、将E.coli DH5单菌落接种于3mlLB培 养液中，37震荡培养过夜。2、取30l液体培养液加入3mlLB液体培养基中，37下震荡培养，至光密度值 OD600在0.50.6之间（5107 个/ml）。3、取1ml E.coli液体培养液于1.5ml的离心管中，4000rpm，4 离心 3min。,实 验 步 骤,4、快速的吸除上清，向沉淀中加入1ml冰 冷的0.1M CaCl2溶液，使沉淀充分悬浮，动 作要轻柔，置于冰上30min，4000rpm，4 离心3min。5、弃上清，加入lml 冻存液（含15%甘油的0.1M CaCl2溶液）溶液，使沉淀充分悬浮，以每管0.1ml的规格分装3管，冻存于-80，可保存46个月。,实 验 步 骤,注 意 事 项,1、不要用经过多次转接或储存与4的培养 菌，最好从-80甘油保存的菌种中直接 转接用于制备感受态细胞的菌液。2、细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 宜，可以通过监测培养液的OD600控制。DH5菌株的OD600为0.5时，细胞密度比 较合适。密度过高或不足均会影响转化 效率。,注 意 事 项,3、进行热激制备感受态细胞时要控制好 时间。4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌 体破裂，影响转化。,思 考 题,1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪 些？,内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选,实验目的,实验原理,实验仪器、材料、试剂,实验步骤,1,2,3,4,注意事项,思考题,5,6,实 验 目 的,了解转化的概念及其在分子生物学研究中 的意义。学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。,实 验 原 理,转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌细胞，并使其生物学特性发生可遗传的变化的过程，是基因工程等研究领域的基本实验技术。,转化的方法：(1)化学的方法(热激法)：使用化学试剂(如CaCl2)制备的感受态细胞，通过热激处理将载体DNA分子导入受体细胞；(2)电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,实 验 原 理,用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并在宿主中实现其携带基因的转录、表达。,实 验 原 理,实 验 原 理,转化体的筛选方法：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。,实 验 原 理,如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。,实 验 原 理,本实验使用的pGEX-4T-2质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp)，理论上只有转入了质粒的大肠杆菌才能在含Amp的培养基生长。但抗性筛选只是初步的筛选，可能仍有部分未转进质粒的细菌能在抗性培养基上生存（假阳性），因此还需要通过提取质粒酶切、电泳作进一步的鉴定。,实 验 原 理,实验仪器、材料、试剂,1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热 恒温培养箱，无菌工作台，微 量移液枪。2、材料：DH5感受态细胞、质粒pGEX-4T23、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉 素Amp（50mg/ml）。,实 验 步 骤,1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA，同时做一个空白对照（由第一组完成）。,转化体系 100ul 1ul,空白对照 100ul 1ul,感受态细胞 质粒DNA 蒸馏水,2、轻轻混匀，立即放在冰上30min；3、42水浴90s，然后迅速冰浴1-2min；4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 培养 40min；5、稀释后，取培养液100ul，涂布于含有50ug/ml Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；6、平板倒置，37，过夜培养。,实 验 步 骤,
