基因克隆操作过程.ppt

第六章 基因克隆操作过程,2011-10-23,1,基因克隆操作过程,基因克隆操作过程,基因克隆操作过程概述,1.DNA的体外重组酶切和连接（切、接）2.重组DNA分子的转化和扩增（转、增）3.转化子的筛选和鉴定（检）,2011-10-23,2,切,接,检,转,增,restriction endonuclease,DNA ligase,2011-10-23,3,基因克隆操作过程,一、DNA的体外重组（切与接）,2011-10-23,4,基因克隆操作过程,1.DNA的体外重组（一）切,工具：限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）作用对象：目的基因片段、载体目的：获得具有互补粘性末端（或平末端）的线性目的基因片段和线性化载体,2011-10-23,5,基因克隆操作过程,6,基因克隆操作过程,Hind III,EcoR I,Pvu II,2011-10-23,7,基因克隆操作过程,双酶联合酶切所使用的buffer（Takara）,各种限制酶酶切反应所使用的buffer（Takara）,2011-10-23,单酶切实例（Takara）,2011-10-23,8,基因克隆操作过程,双酶联合酶切实例（Takara）,2011-10-23,9,基因克隆操作过程,2.DNA的体外重组（二）接,工具：DNA连接酶（DNA ligase）作用对象：具有互补粘性末端（或平末端）的线性目的基因片段和线性化载体目的：获得含有目的基因的环状载体,2011-10-23,10,基因克隆操作过程,2011-10-23,5,5,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,5,5,5,5,EcoRI,退火,T4-DNA ligase,a)获得连接方向不同的两种产物；b)需要鉴定目的基因的连接方向,（1）单酶切产生的粘性末端的连接,11,基因克隆操作过程,同尾酶：能切割产生相同末端的限制性内切酶。同尾酶一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。所有钝末端酶产生的末端均是相同的，但一般不作为同尾酶来研究。同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大,（2）同尾酶产生的粘性末端的连接,Takara网站提供的同尾酶信息,2011-10-23,12,基因克隆操作过程,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,5,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,5,5,BclI,BamHI,退火,T4-DNA ligase,a)获得连接方向不同的两种产物；b)需要鉴定目的基因的连接方向；c)目的产物中对应位置的序列不再是原来的酶切位点,2011-10-23,13,基因克隆操作过程,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,G,ACGTC,3,5,5,3,切平,5,5,G,C,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,5,（3）不同粘性末端的连接,PstI,BamHI,T4-DNA polymerase,Klenow,T4-DNA ligase,a)获得连接方向不同的两种产物；b)需要鉴定目的基因的连接方向；,c)目的产物中对应位置的序列不再是原来的酶切位点,2011-10-23,14,基因克隆操作过程,（4）双酶联合酶切产生的不同粘性末端的连接,CTGCAGNNNNNNNNNGGATCC,GACGTCNNNNNNNNNCCTAGG,PstI,CTGCA GATCC,G G,BamHI,GGATCC CTGCAG,CCTAGG GACGTC,PstI,BamHI,GATCC CTGCA,G G,退火,CTGCA G G GATCC,G ACGTC CCTAG G,T4-DNA ligase,CTGCAG GGATCC,GACGTC CCTAGG,a)连接产物中目的基因的方向是确定的。,2011-10-23,15,基因克隆操作过程,基因克隆操作过程,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,5 AATTC,G,5,5,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,GAATT,CTTAA 5,5,5 AATTC,TTAAG,GAATTGGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGGTTAAG,GGATCCCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCCCTAGG,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,5,5,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,Klenow,补平,Klenow,补平,TdT,dGTP,TdT,dCTP,退火,T4-DNA ligase,（5）人工粘性末端的连接：5突出末端,获得连接方向不同的两种产物,EcoRI,BamHI,BamHI,BamHI,2011-10-23,16,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,GCATGCCCCCC 3,C,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,TdT,dCTP,TdT,dGTP,退火,Klenow,T4-DNA ligase,（6）人工粘性末端的连接：3突出末端,获得连接方向不同的两种产物,SphI,PstI,PstI,PstI,2011-10-23,17,基因克隆操作过程,C 3,G,G,5,G 3,C,5,C,3 G,GTTTTTTTTTT 3,C,C,3 TTTTTTTTTTG,CAAAAAAAAAA 3,G,G,3 AAAAAAAAAAC,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,C,3,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,TdT,dTTP,TdT,dATP,退火,T4-DNA ligase,加热,S1 nuclease,（7）人工粘性末端的连接：平头末端,2011-10-23,18,基因克隆操作过程,5,5,T4-DNA ligase,GATCC,5,G,5,G,CCTAG,5,5,5,GGATC,CCTAG,5,GATCC,CTAGG,5,5,GGATCGGAATTCCGATCC,CCTAGCCTTAAGGCTAGG,5,5,GGAATTCC,CCTTAAGG,BamHI,Klenow,补平,（8）粘性末端的更换,EcoRI linker,EcoRI,2011-10-23,19,基因克隆操作过程,重组率,重组率的定义：含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数。（1）在常规实验条件下，重组率一般为25-75%；（2）重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。,提高重组率的方法（1）提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1（2）载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：防止载体自连,碱性磷酸单酯酶CIP、BAP：催化核酸分子脱掉5磷酸基团,2011-10-23,20,基因克隆操作过程,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,GCATGCCCCCC 3,C,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,TdT,dCTP,TdT,dGTP,退火,Klenow,T4-DNA ligase,（3）加装同聚尾末端：,2011-10-23,21,基因克隆操作过程,DNA ligase介导的体外连接实例（Takara）,2011-10-23,22,基因克隆操作过程,二、重组DNA分子的转化和扩增（转与增）,2011-10-23,23,基因克隆操作过程,1.转化的原理与技术,（1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,原理：Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立。其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。处于感受态的细菌，容易接受外源DNA。,2011-10-23,24,基因克隆操作过程,2+,分子克隆第三版,OD600=0.4左右,2011-10-23,25,基因克隆操作过程,分子克隆第三版,2011-10-23,26,基因克隆操作过程,Ca2+诱导转化过程中应注意的事项转化所用DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%；热击过程中不要摇晃离心管；检测转化子的Amp抗性时，转化子铺平板时密度应低一些（104菌落/板）；转化子于37培养不要超过20小时。因为铺板过密或培养时间过久会导致平板上出现对Amp敏感的卫星菌落。转化过程中37温育菌体使细菌复苏时的转速不可过高，为得到较高的转化效率，应使转速小于225rpm。当用于涂板的转化液过多时，应离心浓缩（4100rpm，5min），并用适量SOC液体培养基重悬菌体沉淀后涂板。刚进行完转化的菌体比较脆弱，涂板时应轻轻涂布。,2011-10-23,27,基因克隆操作过程,提高转化效率的几个重要因素：细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。,2011-10-23,28,基因克隆操作过程,质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。,2011-10-23,29,基因克隆操作过程,试剂的质量:所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制（过滤除菌，非高压灭菌），最好分装保存于干燥的冷暗处（冰箱4）。防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选和鉴定带来不必要的麻烦。,2011-10-23,30,基因克隆操作过程,2011-10-23,31,基因克隆操作过程,（2）细菌原生质体的转化适用对象：革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等），其接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常去除细胞壁后再进行转化，这与酵母菌、霉菌、植物细胞等类似。细菌原生质体的制备：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同。以链霉菌为例，细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水、无去污剂。细菌原生质体的转化：由PEG和Ca2+介导细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。,（3）噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30继续培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。,2011-10-23,32,基因克隆操作过程,（4）电穿孔转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。特点：电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。,2011-10-23,33,基因克隆操作过程,（5）酵母的转化一般有以下两种方法：利用酵母的原生质球进行转化 利用Li+盐进行转化（6）植物细胞的转化及其他基因转移方法叶盘法 电击法 基因枪法（7）哺乳动物细胞基因导入法磷酸钙沉淀法 脂质体载体法显微注射法DEAE葡聚糖转染技术,2011-10-23,34,基因克隆操作过程,2.转化率,（1）转化率的定义,转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，能够接纳DNA的受体细胞数目，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞无法生长）。,2011-10-23,35,基因克隆操作过程,例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.41011个分子，也就是说，每3400个pUC18分子中才有一个分子进入受体细胞。,另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2mL感受态细胞，大约含有21010 个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞中只有一个细胞能接纳pUC18 DNA。,2011-10-23,36,基因克隆操作过程,（2）转化率的用途,利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模,例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/g载体，经切、接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？,若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：,104/（107/gX 10-2）=0.1 g 载体DNA,考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：,0.1/20%=0.5 g 载体DNA,载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算,出（5 g），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。,2011-10-23,37,基因克隆操作过程,（3）转化率的影响因素,载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。,受体细胞：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。,2011-10-23,38,基因克隆操作过程,供体、受体的比例：Ca2+诱导转化 0.1ml 感受态细胞 50ng DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50ng DNA转化方法：Ca2+诱导转化：106-107/g DNA 原生质体转化：105-106/g DNA-DNA转染：107-108/g DNA 电穿孔转化：106-109/g DNA,3.转化细胞的扩增,（1）扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后，37培养一个小时；原生质体转化后的再生过程；噬菌体转染后，30培养10min等，均属扩增操作。,（2）扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序；扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选；表达外源基因，便于筛选和鉴定。,2011-10-23,39,基因克隆操作过程,三、转化子的筛选和鉴定（检）,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子。,2011-10-23,40,基因克隆操作过程,1.载体遗传标记检测,（1）抗药性筛选法,将外源DNA片段插在BamHI位点：非转化子呈 Ampr、Tcr转化子呈 Ampr、Tcs,2011-10-23,41,基因克隆操作过程,Ap,抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Amp的平板；再将Amp平板上的菌落影印至含有Amp和Tc的平板上；在Amp平板上生长、但在Amp和Tc平板上不长的菌落即为转化子。,挑选,影印Ap+Tc,2011-10-23,42,基因克隆操作过程,（2）营养缺陷型筛选法,营养缺陷型筛选法的基本原理：载体分子上携带某种营养组分的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组分，将转化细胞涂布在不含此营养组分的培养基上，长出的便是转化子。,常见的营养缺陷型筛选标记：（1）用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp；（2）用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型。,2011-10-23,43,基因克隆操作过程,（3）显色筛选法,显色筛选法的基本原理：载体分子上携带某种酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（编码半乳糖苷酶，蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（编码酪氨酸酶，黑色反应）等。,2011-10-23,44,基因克隆操作过程,显色筛选法的基本操作：,将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时转化子为Ampr、lacZ-，呈淡黄色或白色菌落；而非转化子则为Ampr、lacZ+，呈蓝色菌落蓝白斑筛选。,IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷；X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷,是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的显色底物,2011-10-23,45,基因克隆操作过程,2.克隆DNA序列检测,（1）限制性酶切图谱法,所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，从而有效地鉴定转化子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,2011-10-23,46,基因克隆操作过程,用BamHI酶切待鉴定菌落的质粒DNA，电泳观察酶解产物片段。,转化子：,2.7 kb+4.0 kb,非转化子：2.7 kb如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好,选用单一切口的酶将质粒线性化，然后通过其长度来鉴定其是否为转化子。,2011-10-23,47,基因克隆操作过程,用EcoRI酶切待鉴定菌落的质粒DNA,转化子：3.0 kb+3.7 kb 或1.0 kb+5.7 kb,用PstI酶切带鉴定菌落的质粒DNA,转化子：3.2 kb+3.5 kb 或0.8 kb+5.9 kb,2011-10-23,48,基因克隆操作过程,（2）菌落/噬菌斑原位杂交法,菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。,2011-10-23,49,基因克隆操作过程,菌落原位杂交法的基本操作：用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜；用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜；80烘干固定影印薄膜；薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜；用X光胶片覆盖薄膜感光。,2011-10-23,50,基因克隆操作过程,（3）DNA序列分析法,DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段；通过序列比对软件分析确定转化子：DNAMAN、Blast、ClustalW,2011-10-23,51,基因克隆操作过程,DNA自动测序结果举例,2011-10-23,52,基因克隆操作过程,3.外源基因产物检测,（1）蛋白质生物功能测定法,a)淀粉酶目的基因的鉴定：,淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的转化子可表达淀粉酶并分泌到胞外，均匀扩散，降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，转化子菌落周围会形成透明圈。如果透明圈不明显，还可往培养板上喷洒碘液，使淀粉所在区域呈蓝色本底，易于辨认。,b)蛋白酶、脂肪酶目的基因的鉴定：方法与上类似蛋白酶：水解酪蛋白脂肪酶：水解甘油酯,2011-10-23,53,基因克隆操作过程,c)抗生素抗性基因的鉴定：,抗生素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的转化子。氨苄青霉素：Amp或Ap 卡那霉素：Kan 壮观霉素：Sp 四环素：Tc,在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生。,2011-10-23,54,基因克隆操作过程,（2）蛋白质生物结构鉴定法免疫沉淀鉴定：在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体；然后涂布转化液；,经培养后，转化子菌落便会分泌出目标蛋白，并与特异性抗体发生免疫沉淀反应，在菌落周围形成白色的圆斑。此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大。,2011-10-23,55,基因克隆操作过程,（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳法,如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选。,2011-10-23,56,基因克隆操作过程,