蛋白质的提取纯化和分析.ppt

,蛋白质的提取纯化和分析,材料选择和预处理,细胞破碎,蛋白质的粗提,目 录,题目分析,蛋白质的纯化,分析检测,题目解析,已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点3.94.1，它能耐一定的高温，在90 C加热34 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。,在钙离子的作用下才能起到暴露疏水集团发挥性能，结合蛋白质基础知识从而可以判断其为钙调蛋白。,TEXT,成年健康雄性大鼠脑组织20克（比雌鼠体积大，成本较低物种易获得）,将切取的组织用4预 冷0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲液）,预处理过的组织,细胞破碎（高速珠磨法）,制备组织细胞悬液（剪碎法）,蛋白质被释放出来,破碎,剪碎法,1.将组织块放入平皿后，加入少量PBS；,2.用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10 ml PBS；,3.用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；,返回,高速珠磨法,破碎机理：,高速珠磨法是一种有效的细胞破碎方法，珠磨机是该法所用的设备，其结构示意图见图（1）。微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞促进细胞膜破裂，释出内含物。,在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作。破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。,钙调蛋白的粗提取,抽提 蛋白质破碎后，使用适当的溶剂，将蛋白质提取溶解到溶剂当中，常用稀酸、稀碱、有机溶剂,等电点3.94.1,酸性蛋白质,稀碱性溶液抽提,溶液碱性的程度，碱性过大则难以复性,pH调至等电点偏碱的一侧（4.1）,粗提取物,离心操作,除去固体杂质的上清液,热变性初步纯化,天然结构%,钙调蛋白,一般蛋白,100,热稳定性不同,其他方法,盐析法,等电点法,有机溶剂法,蛋白质的精纯和分析鉴定,亲和色谱,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,洗脱,结合,耦联,作用机理,金属螯合亲和层析,钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端有两个Ca2+结构域,每个结构域可以结合一Ca2+,这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+,钙调蛋白与Ca2+结合后的构型相当稳定。,金属螯合色谱,原理：利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基 与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相 上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱 氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合 作用而进行分离,步骤,1.制作金属螯合亲和色谱柱：用浓度为0.2 mol/L的CaCl2溶液上柱。将上清液PH调制6-8，加入蛋白质解离抑制剂。慢上样3.再用配体CaCl2溶液洗脱，下方流出为目的蛋白液，用大使管或者烧杯盛装之。,2.上柱后依次用50ml bufferB、200ml含0.5mol/L NaCl的bufferB洗脱。下方用大试管或烧杯收集杂质液。,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,步骤,目的：除去蛋白液中配体离子,凝胶过滤色谱的洗脱,分析鉴定,定性分析,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量,用SDS-PAGE检测不同纯化阶段所获得的提取液样品中CaM的纯度与相对分子质量。电泳采用质量分数为15%的分离胶和质量分数为5%的浓缩胶，120V 电压条件下进行电泳，直至溴酚蓝达到凝胶底部，考马斯亮蓝染色，凝胶成像仪成像。,当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,定量分析,goals,Folin-酚试剂法,在碱性条件下蛋白质和铜作用生成蛋白质-铜络合物,此络合物将Folin试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。,Thank you!,