蛋白质的定量测定一-双缩脲法.ppt
,浙江中医药大学 生命科学学院,生物化学教研室,蛋白质含量测定,引言：蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。,目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法。化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法等。染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。其他性质：免疫比浊法。,蛋白质的定量测定双缩脲法,实验目的要求 1、学习分光光度法原理，了解分光光度计的结构。2、掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。3、了解标准曲线的制作方法及其在物质定量测定中的应用。,分光光度法原理,分光光度法，常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。,Lambert定律,一束平行单色光垂直照射于一均匀物质（溶液）时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。设：入射光强度为I0 L表示溶液的厚度（即光程）出射光（透过光）强度为I根据辐射能理论推导，I0与I之间关系为 lg（I0/I）=K1L（1）K1是常数，受光线波长、溶液性质、溶液浓度的影响。,Beer定律,当一束单色光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若溶液的厚度不变，则溶液浓度C愈大，光吸收愈大，透射光线强度的减弱也愈显著，光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比 lg（I0/I）=K2C（2）K2为吸收系数，是常数，溶液对光吸收的大小与溶液浓度C成正比。,Lambert-Beer定律（又称吸收定律）,上二式合并（即（l）与（2）合并）lg（I0/I）=CL 令A=lg（I0/I），T=I/I0；则 A=CL，A=-lgT。T为透光率，A为吸光度（光密度、消光度）。其中为常数，又称消光系数（extinction coefficient），表示物质对光线吸收的能力，其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。,分光光度计的结构,光源：钨灯和氢灯（或氘灯）单色器：分解为单一波长光的装置 狭缝：调节入射单色光的强度，形成平行光 线 吸收池：又称比色杯、比色皿、比色池，装待测溶液用 检测系统：感受光能，转化为电能，输出A值、T值。,本室几类分光光度计,22PC型可见光分光光度计 UNICO2000型,S54型紫外分光光度计 UV8500型紫外分光光度计,比色杯（比色皿）,玻璃比色杯 石英比色杯 荧光比色杯,比色杯使用注意事项,1、拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，避免接触光学面。2、不得将光学面与硬物或脏物接触。盛装溶液时，高度为比色皿的2/3处即可，光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用檫镜纸擦拭。3、比色皿在使用后，应立即用水冲洗干净。必要时可用1：1的盐酸浸泡，然后用水冲洗干净。4、不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤；5、在测量时如对比色皿有怀疑，可自行检测。,微量移液器,吸嘴装在吸液杆上，应套牢避免间隙。依据所需容量旋转手轮，使数轮显示所需值。轻轻地将推动按钮下压，使推动按钮推移至第一停点位置。手持取液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度为2-4mm，停留2-3秒后缓慢放松按钮，即回到原来位置，溶液吸入后稍停即可将吸嘴移出液面。将取液器吸嘴置于排液容器内。使吸嘴尖紧贴容器内壁，按压推动按钮至第二停点位置，使溶液排尽，松开按钮。移液完毕，按压卸嘴按钮，将吸嘴脱卸。,【实验原理】具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。,紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：,但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有H2NOC-NH-CONH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。,【实验材料】1试剂（1）双缩脲试剂：取1.50g硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H4O64H2O），用500mL水溶解，在搅拌下加入300mL 10氢氧化钠溶液，1.0g KI；用水稀释到1000mL，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中），避光保存。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色或暗红色沉淀出现，则需重新配制。,2标准和待测蛋白质溶液：（1）标准蛋白溶液：10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。,（2）待测蛋白质溶液：测定血清等样品时需做适当稀释，使其浓度在标准曲线测试范围内。3器材 试管、试管架、刻度吸管、微量移液器、旋涡混合器、22PC型、UNICO2000型可见分光光度计、S54型、UV-8500型紫外分光光度计。,【实验方法】1制作标准曲线 取6支干燥洁净试管编号，按下表加入下列试剂：,采用标准曲线法，即A540(540nm吸光度值)为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2样品测定 取2支试管，加入待测样品液各1ml，加入双缩脲试剂4ml，室温下（2025）放置30min，用分光光度计测定吸光度。3.结果由测得的吸光度在标准曲线上查得样品浓度。以mg/ml计。,【注意事项】1本实验方法测定范围110mg/ml蛋白质。2各管由显色到比色的时间应尽可能一致。3有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。,实验报告书写要求,按以下序列书写：1 实验目的2 实验原理3 实验材料4 实验步骤5 实验结果与分析,
