红霉素发酵工艺控制及操作.ppt

红霉素发酵工艺控制及操作,讲师：king电话：,1.概述.温度的影响及其控制.pH的影响及控制.溶氧的影响和控制.泡沫的影响和控制.红霉素发酵现场操作要点.红色糖多孢菌各周期阶段形态,一、发酵工艺的控制,1.概述,发酵过程控制是发酵的重要部分控制难点：过程的不确定性和参数的非线性发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对于优化发酵是十分必要的,一、发酵过程的方式,二、发酵过程的代谢参数,一、发酵过程的方式,分批培养补料分批培养半连续培养连续培养,分批培养中微生物的生长规律,迟滞期,对数生长期,稳 定 期,死亡期,迟滞期：菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。对数生长期：当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累，稳定期：随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期死亡期：最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期，而次级代谢产物则在对数生长期后期和稳定期大量合成。,1、分批发酵(间隙发酵)最简单的发酵过程，培养基灭菌后,接入菌种，进行发酵,除了空气的通入和排气外,没有物料的加入和取出。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓度和产物浓度等参数都随时间变化。,分批培养的优缺点：,优点：操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程容易掌握缺点：产率低,2、补料分批培养,在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，在工厂的实际生产中采用这种方法很多。补料分批培养的优缺点:优点:在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件。缺点:由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降;增加了染菌机会,3、半连续培养,在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。半连续培养的优缺点优点:放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。缺点:代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大,4、连续培养,发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，基质浓度都是恒定的。连续培养的优缺点优点：控制稀释速率可以使发酵过程最优化。发酵周期长，得到高的产量。缺点：菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增加。,二、发酵过程的代谢参数,发酵过程的分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断。,代谢参数按性质分可分三类：物理参数：温度、转速、压力、空气流量、粘度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、溶解氧、pH、产物浓度等生物参数：菌丝形态、菌浓度、呼吸强度、关键酶活力等,发酵过程的主要控制参数,1.物理参数（1）温度（）直接影响发酵过程的酶反应速率，氧的溶解度和传递速率，菌体生长速率和合成速率。（2）压力（Pa）影响发酵过程氧和CO2的溶解度，正压防止外界杂菌污染。罐压一般控制在0.02MPa0.06MPa。,（4）空气流量（m3空气/（m3发酵液min）单位时间内单位体积发酵液里通入空气的体积，一般控制在10005400（m3空气/（m3发酵液hr）（5）粘度（Pas）细胞生长或细胞形态的一种标志，反映发酵罐中的菌丝分裂情况，表示菌体的浓度。,（3）搅拌速度（r/min）搅拌器在发酵过程中的转动速度。其大小影响发酵过程氧的传递速率。,2.化学参数（1）pH（酸碱度）发酵工艺重要的参数之一，与菌体生长和产物合成有密切关系。包括起始pH，发酵过程中的pH。（2）基质浓度（g/L）发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度，对菌体的生长和代谢合成有重要影响，是产物代谢控制的重要手段。（3）溶解氧浓度（饱和度，）溶解氧是好氧发酵的必备条件，通常用饱和百分度表示。,3.生物参数（1）菌丝形态菌丝形态是衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。（2）菌体浓度菌体浓度是控制微生物发酵的重要参数之一。生产上，常常根据菌体浓度来决定补料量和供氧量，以保证生产达到预期水平。,生物发酵过程中重要控制点及影响,一、温度对微生物生长的影响二、氧气对微生物生长的影响三、pH值对微生物生长的影响,（一）微生物生长的三个温度基点,从微生物整体来看:生长的温度范围一般在-10 100 极端下限为-30，极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物：只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度,处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。,（二）微生物生长温度类型,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为三个类型：,低温型微生物（嗜冷微生物）中温型微生物（嗜温微生物）高温型微生物（嗜热微生物）,温度对微生物生长的影响,随着温度上升，微生物的生长和繁殖加快，但随着温度的上升，酶失活的速度也加快，菌体衰老提前，发酵周期缩短，这对发酵生产是极为不利的。,微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。,不同生理生化过程的最适温度,微生物不同生理活动要求不同温度，所以，最适生长温度 发酵速度快、积累代谢产物多。,菌 名生长温度发酵温度累积产物温度 链球乳杆菌3440产细胞：2530产乳酸：30 红色糖多孢菌 34 3035_ 青霉菌302520,1、影响发酵温度的因素,发酵液的温度变化受生物热、搅拌热、蒸发热、辐射热 和显热的影响，用公式表示为：Q发酵Q生物+Q搅拌Q蒸发 Q辐射Q显,（1）生物热、搅拌热,生物热：是菌体在生长繁殖过程中产生的热能，来自菌体的分解代谢，生物热的大小和菌种、培养基成分和菌体的呼吸强度有关。培养基愈丰富，生物热愈大；细胞数量愈多，生物热愈大；呼吸强度愈高，生物热愈大。搅拌热：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量，,（2）蒸发热、显热和辐射热,蒸发热：空气进入发酵罐，与醪液充分混合，引起水分蒸所需的热能为显热：水分蒸发、进气和废气排出因温度差异所带走的部分热能为辐射热：发酵罐外壁与大气间的温度差异使发酵罐中的部分热能通过罐体向大气辐射的热能为,2.温度的控制,发酵罐在发酵过程中一般不需加热，选用微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的现实意义。生产中，温度的控制是采用冷却水通入发酵罐的蛇管或夹套中，热交换保持恒温发酵的。,二、氧气对微生物生长的影响,微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:,专性好氧菌:好氧菌 微好氧菌：兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌：厌氧菌(专性)厌氧菌：,专性好氧菌（strict aerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。,兼性好氧菌（facultative aerobe）,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶（CAT）。,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,溶解氧及其控制一、溶解氧（dissolved oxygen,DO）对发酵的影响 溶氧要适量，大小与产物的生物合成途径有关。（1）最适氧浓度（optimal oxygen concentration）：菌体生长或产物合成最适浓度范围。（2）临界氧浓度（critical value of dissolved oxygen concentration）：满足微生物呼吸的最低氧浓度（红霉素发酵临界DO值为20）。,溶氧是需氧发酵控制的重要参数之一，氧的溶解度很小，氧的溶解度仅为6.4mg/L，溶氧大小对菌体生长和产物的性质和产量产生不同影响；例如，谷氨酸发酵时，通气不足会积累大量乳酸和琥珀酸；不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求也不相同。例如，天氡酰胺酶发酵，前期为好气培养，后期为厌氧培养，产酶能力会大大提高。,（3）溶氧的控制,溶氧浓度的控制可从供氧和需氧两方面着手，其中供氧是主要的：需氧方面：需氧量与菌体浓度，基质浓度和种类，培养条件有关。供氧方面：生产中常采用加大通气速率，或提高搅拌转速，或适当增加罐压；,*不同体积的罐对设定罐压的要求,为防止发酵罐的液面以上部分在运转过程中有泄露（如轴封部分）外界未经除菌的空气侵入发酵罐中而导致染菌，所以，发酵罐内须保持一定的空气压力。但压力不能保持太高否则影响空气流量，阻滞了二氧化碳的排出。发酵罐越大，保持的压力越低。对小型罐而言，却要保持0.5Kg/cm2的压力。因为小型发酵罐内部液面以上的空间较小，压力的缓冲容量也小，在遇突发事件时（如突然停空气），往往很快失去正压状态，染菌的机率较大。为此，对小型发酵罐的罐内压力保持得高一点，以增加缓冲量。,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说：,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，尤其是超氧阴离子自由基，如过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2-）等。好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等，而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,三、pH值与微生物生长的相互影响,（一）环境pH值对微生物生长的影响,影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸。环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。,不同微生物对pH要求不同,微生物生长pH值范围极广，但绝大多数生活在pH5.09.0之间。微生物生长的pH值三基点：各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。不同的微生物最适生长的pH值不同。根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为：嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌,不同微生物的生长pH值范围,微生物 pH值 最低 最适 最高Thiobacillus thiooxidans 氧化硫硫杆菌 0.5 2.03.5 6.0Lactobacillus acidophilus 嗜酸乳杆菌 4.04.6 5.86.6 6.8Rhizobium japonicum 大豆根瘤菌 4.2 6.87.0 11.0Azotobacter chroococcum 圆褐固氮 4.5 7.47.6 9.0Nitrosomonas sp.硝化单胞菌 7.0 7.88.6 9.4Acetobacter aceti 醋化醋杆菌 4.04.5 5.46.3 7.08.0Staphylococcus aureus 金黄葡球菌 4.2 7.07.5 9.3Chlorobium limicola 泥生绿菌 6.0 6.8 7.0Thurmus aquaticus 水生栖热菌 6.0 7.57.8 9.5Aspergillus niger 黑曲霉 1.5 5.06.0 9.0一般放线菌 5.0 7.08.0 10.0一般酵母菌 3.0 5.06.0 8.0,生长的最适pH值与发酵的最适pH值,同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH值尤其重要，举例：Aspergillus niger在pH22.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。丙酮丁醇梭菌在pH5.57.0范围时，以菌体生长为主，而在pH4.35.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH灰色链霉菌6.36.9 6.77.3红霉素链霉菌6.67.0 6.87.3产黄青霉6.57.2 6.26.8金霉素链霉菌6.16.6 5.96.3龟裂链霉菌6.06.6 5.86.1灰黄青霉6.47.0 6.26.5,（二）、影响发酵pH变化的因素：,pH的变化决定于所用的生产菌：1、基质代谢（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一。（2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后，pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降。2、产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。3、菌体自：pH上升，发酵后期，pH上升。,（三）、pH的控制,采用合适的培养基配比C：N合适生理酸性物质和生理碱性物质比例合适添加缓冲物质：碳酸钙和磷酸盐在发酵过程中直接补加酸或碱过去流加硫酸或氢氧化钠，现采用补加氨水、尿素、硫酸铵在发酵过程中调节补糖速度控制pH,五 泡沫的影响与控制,（一）、泡沫对发酵的影响泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵；使发酵液的装料系数减少。由于泡沫大量生成，致使培养液的容量一般只能等于种子罐容量的一半左右，大大影响了设备的利用率。大量的泡沫易造成逃液。增加污染杂菌的机会。造成巨大损失。,（二）、泡沫的控制方法,减少培养基中易起泡的成分减少培养基中粘度大的成分,适当减少通气量及搅拌转速,采用机械消泡（罐内装置和罐外装置）,采用消泡剂消泡,1.机械消泡：（物理方法）利用机械振动或压力变化使泡沫破裂。罐内消泡:靠罐内消泡浆打碎泡沫。罐外消泡：靠喷嘴的加速作用消除泡沫。,2.化学消泡（消泡剂）,天然油脂类 玉米油、豆油、棉籽油、鱼油等高碳醇类 十八醇、乙二醇聚合物聚醚类 聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯丙烯甘油硅酮类 聚二甲基硅氧烷,泡沫的检测和控制,最简单的检测是定时在发酵罐视孔上观察泡沫产生情况，发现泡沫持续上升时，开启消泡剂贮罐的阀门，流加少量消泡剂（例如：豆油），使泡沫消失即可。也可在罐内顶部装液位仪与控制仪表连结，用以控制消泡贮率阀门的开启。当泡沫上升接触探头顶端时产生的信号，通过控制装置，指令打开泵开关或阀门，自动加入消泡剂，泡沫消失，信号也随之消失，阀门关闭。,泡沫的形成,1、通气搅拌的强烈程度通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。,2、培养基配比与原料组成培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。例：在50L罐中投料10L，成分为淀粉水解糖、豆饼水解液、玉米浆等，搅拌900 rpm，通气，泡沫生成量为培养基的2倍。如培养基适当稀一些，接种量大一些，生长速度快些，前期就容易开搅拌。,3、菌种、种子质量和接种量菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生机率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量。4、灭菌质量培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。,六、红霉素发酵操作要点,1、补料 补料系统中水、醇、油是所用发酵罐共用一个流量计。糖系统是每个发酵罐使用一个流量计。,补料流量计,补料系统旁通,气动截止阀（开）,气动截止阀关,四楼糖系统流量计,四楼补料架,2、pH电极、DO电极,PH、DO电极表,3、电极降温水,红霉素发酵各阶段菌丝形态,红霉素斜面,红霉素斜面，孢子,车间红霉素发酵菌丝过程分析,62,接种后（0h),63,5h 积蓄能量始出现小分枝 新老交替 染色深浅差别,64,8h分枝增长新菌丝明显增加染色加深菌丝粗壮生长繁殖活跃耗氧开始变强,65,16h,40h,24h,32h,分枝逐渐伸长，菌丝由蜷缩逐渐伸展，表观黏度快速增加，抗生素开始合成,66,64h,71h,80h,88h,空泡形成，并逐渐增加，产素活跃，黏度开始下降，糖耗旺盛，耗氧也逐渐减弱,67,119h,136h,152h,112h,出现返青现象，菌丝出现断裂，抗生素合成减缓，黏度继续下降，耗氧继续减弱,68,185h,200h,168h,断裂 自溶化稀 泡沫,思考题,1、发酵罐在运转过程中，为什么要保持一定压力，而且罐越小，保持的压力反而比大型罐高？2、发酵前期若溶氧低，常用的调控措施有哪些？,谢谢大家！,END,