癌基因与抑癌基因研究进展.ppt

癌基因与抑癌基因研究进展,最新统计资料显示，中国每年癌症新发病例为220万人，因癌症死亡人数为160万人。近20年来，中国每4-5个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因之首。,第一节 肿瘤的发生机制,一、肿瘤细胞的基本生物学特征（一）肿瘤细胞增殖失控（二）肿瘤细胞分化障碍（三）肿瘤细胞凋亡受阻,二、癌基因,是指存在于致癌病毒、动物和人体中可引起细胞癌变的基因。,（一）病毒癌基因 virus oncogene（v-onc）1968年 Duesberg 等首次发现Rous 肉瘤病毒基因组编码 酪氨酸蛋白激酶 基因，证实它在细胞转化中起关键作用，来自病毒，因而被命名为病毒癌基因,1、RNA肿瘤病毒（逆转录病毒）,（1）RNA肿瘤病毒的分类 根据感染宿主后肿瘤发生快慢分类：1、急性转化病毒 Rouse Sarcoma Virus（Rouse肉瘤病毒）潜伏期短（数周）、可以使培养的细胞癌变。2、慢性转化病毒 Avian Leukosis Virus（禽白血病病毒）潜伏期长、不能使培养细胞发生癌变。,RNA肿瘤病毒是通过激活细胞的原癌基因来起作用的。,（2）机制,逆转录病毒与细胞癌基因活化RNA病毒 原癌基因结构异常 癌变,随机插入,protein1,protein2,LTR,gag,pol,env,LTR,Virus DNA,Virus protein,LTR,gag,LTR,V-onc,Transforming Virus DNA,Virus protein,逆转录病毒和携带细胞基因序列病毒基因组比较,2、DNA肿瘤病毒,如SV40、HPV、EB、乙肝病毒等其引起细胞恶性转化的机理可能在于：存在于细胞中部分整合的或整个的DNA病毒引起细胞的癌基因 功能紊乱DNA病毒表达癌基因样蛋白产物DNA病毒蛋白产物与某些细胞癌基因蛋白产物之间相互作用。,（二）细胞癌基因（又称原癌基因）,原癌基因（oncogene）是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高度保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。,（三）原癌基因的分类,生长因子:如sis 生长因子受体:如fms、erbB 蛋白激酶及其它信号转导组分:如src、ras、raf 细胞周期蛋白:如bcl-1 细胞凋亡调控因子:如bcl-2 转录因子:如myc、fos、jun,按原癌基因的结构、产物的功能、所在的位置分为下列几类：,一些原癌基因的功能,（四）原癌基因的活化机制,1.基因重排 2.基因扩增 3.点突变 4.其它调控的异常,1、基因重排,(1)插入具有高活性的启动子或增强子，使 原癌基因持久、过量地表达(2)负调控区的失活或丢失,插入具有高活性的启动子或增强子，使原癌基因持久、过量地表达,插入的启动子或增强子来自细胞外（外源性）如：鸡B淋巴细胞瘤由于ALV的LTR插入 c-myc 的旁侧（5或3端），使c-myc过量表达插入的启动子或增强子来自细胞内（内源性）如：内源性逆转录病毒的LTR,染色体易位是原癌基因DNA重排的典型例子 人B淋巴瘤中免疫球蛋白基因与c-myc的重排，使c-myc激活:c-myc基因定位于8q24，Ig、Ig、Ig 链的基因位点分别定位在14q32、2p13和22q11c-myc易位到Ig位点的高活性转录区，从而组成一个高转活性的重排基因，启动c-myc转录，使 c-myc表达增强，促进细胞恶变，最后导致肿瘤的发生,(2)负调控区的失活或丢失,小鼠c-myc，c-fos，c-mos等原癌基因在旁侧顺序具有抑制转录启动的负调控区人c-myc的负调控区在5端428-1188bp处，而在B淋巴瘤中，该区有多点突变或部分丢失虽然这一结论还有待更多实验证实；但是，原癌基因上游或下游旁侧顺序存在负调控区（并不是个别现象），因而使原癌基因被激活的可能性大为减少,2、点突变,在 ras 基因族，在人体肿瘤中已从膀胱、小细胞肺癌（Ha-ras，Kit-ras），胃（N-ras），乳腺（Ha-ras）等证明在12或61号编码子出现点突变所导致一个氨基酸的置换 突变（一个氨基酸置换）可使其编码产物蛋白p21的 GTPase 活性明显下降，从而影响p21的生物学活性,3、基因扩增,基因扩增，可导致基因过量表达基因扩增一般被认为与恶性演进有关，未必是恶性早期的改变在人体肿瘤中，如：人肝癌中出现 N-ras 重排及其基因扩增小细胞肺癌中 c-myc 及 L-myc 基因扩增与癌转移可能有关神经母细胞瘤中 N-myc 基因扩增明显与病程发展有关,4、其它调控的异常,反式（Trans）调控系统转录后的调控异常,反式（Trans）调控系统,已证明某些基因产物可影响其它基因的转录，如：病毒HTLV-，中TAT（LOR）区SV40中的某些片段RSV的gag区原癌基因很可能会接受其它基因（包括病毒的基因产物）的控制或影响如：v-myc 进入细胞后，可关闭细胞本身c-myc的表达，同时，c-myc激活后亦可使另一个正常表达的 c-myc 等位基因关闭，提示：myc 产物或由myc 诱导产生的物质对c-myc的转录发生Trans的负控制,转录后的调控异常,成纤维细胞经生长因子处理后，结果：c-myc 的mRNA量增高转录水平并不改变说明：mRNA转录后加工或稳定性的改变基因的转录后调控：当前了解甚少，原癌基因的转录后调控的异常了解的更少,ras 癌基因家族,1982年活化的H-ras基因在人膀胱癌细胞系中首先被发现，ras基因在人类肿瘤发生发展中所起的作用引起了极大关注。ras 基因家族中与人类肿瘤相关的特征性基因有：H-ras 定位于11号染色体 K-ras 定位于12号染色体 N-ras 定位于 1号染色体 作用：参与细胞生长和分化的调控；参与多种肿瘤的形成与发展,举例,（一）ras家族的基因所共有的特征为：,1.基因组中有5个外显子：4个编码的外显子和1个5端非编码外显子 2.3类ras基因被翻译成4种Ras蛋白：H-Ras、N-Ras、K-RasA和 K-RasB。除K-RasB(含189个氨基酸)外，其他Ras蛋白均含有 188个氨基酸；分子量为21kD（p21蛋白）。这些蛋白具有高度特异性和同源性，尤其在氨基酸序列的前 80个氨基酸残基中，几乎无种属间差别，具有高度保守性。,正常ras蛋白具有以下特点：,p21（ras蛋白）位于细胞膜的内侧面，以软脂酸共价键形式固定于脂质双层膜的内表面。ras蛋白是一种信号传递蛋白，其功能是调节细胞的分化增殖；正常情况下为与GDP结合的非活化状态，与GTP结合后则变成活化状态。ras蛋白的信号传递过程如下：外源性增殖信号如表皮生长因子(EGF)结合细胞膜上的受体(her2)受体胞膜内侧的酪氨酸残基发生磷酸化 结合于适配蛋白如Grb2的SH2区 Grb2分子的SH3区与SOS蛋白相合 SOS蛋白促进p21与GDP分离然后与GTP结合而活化 活化的p21又激活下游的效应子：如丝氨酸-苏氨酸激酶(raf-1)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、磷酸脂酶C(PLC)启动相应的效应链，从而导致细胞的增殖。,（二）ras基因异常与细胞恶性转化,正常情况下Ras信号链只有短暂的活性：GTP酶激活蛋白(GAP)激活GTP酶，及时降解与p21结合的GTP；p21Ras自身也有低度GTP酶活性，能够降解与其结合的GTP；从而Ras蛋白转变成与GDP结合的非活性状态。,ras蛋白信号通路出现异常导致细胞恶性转化,(1)ras基因突变-最显著 大约30的人类肿瘤中出现ras基因点突变，最常见是K-ras的点突变(大约占85)，其次是N-ras(约15)，再次是H-ras(小于1)。点突变的ras蛋白失去GTP酶活性，阻止GTP酶激活蛋白对ras蛋白活性形式的水解，从而导致ras蛋白以活性结合形式存在。在人类肿瘤中，几乎所有的ras蛋白活化是由编码子12、13和61的突变所致。,(2)ras蛋白过表达 常见于乳腺癌、膀胱癌、基底细细胞癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、B细胞淋巴瘤，在乳腺癌、膀胱癌、鳞状细胞癌前驱病变中也发现ras蛋白过表达。(3)GTP酶激活蛋白缺失 在肿瘤内ras蛋白也可能由于GTP酶激活蛋白的缺失而活化。最典型的例子就是由NF1基因编码的神经纤维素的缺失，NF1基因具有肿瘤抑制因子的所有特点。I型神经纤维瘤病的患者伴有NF1基因的一个等位基因的缺失，而NF1基因的2个等位基因缺失引起ras蛋白的持续活化从而导致恶性肿瘤的发生。,(4)生长因子受体的活化 ras蛋白信号通路经常由于生长因子受体酪氨酸激酶的过表达而活化。最常见的例子是EGFR和ERBB2，在许多人类肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌和胃癌中ras信号通路由于EGFR和ERBB2的过表达而活化。(5)ras下游效应子的突变或扩增 在人类肿瘤特别是黑色素瘤(约70)和结肠癌(约15)中BRAF经常由于突变而活化；在少部分卵巢肿瘤中磷酸肌醇3激酶通路由于P110基因的扩增而活化，同时在卵巢癌和乳腺癌中，磷酸肌醇3激酶通路由于PDK的下游靶标AKT2的扩增而活化；而且在肿瘤组织中，磷酸肌醇3激酶通路的直接激活是由肿瘤抑制基因PTEN的缺失所致。,（三）ras 基因与人类肿瘤,在所有人类肿瘤细胞的基因突变中，ras突变约占10。其突变频率因肿瘤细胞类型而异：胰腺癌为75-90、结肠癌为40-50、肺癌为30、急性白血病约为25。然而在甲状腺肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、子宫癌以及肝癌中却较少有ras的突变。突变ras基因的种类与某些肿病类型密切相关，即有优势激活现象。如胰腺癌、结肠癌、肺癌等以K-ras突变为主，造血系统肿瘤多发现N-ras的突变，泌尿系肿瘤则以H-ras突变为主。检测ras突变对了解肿瘤的发生发展，以及监测恶性肿瘤的治疗效果具有重大意义。,三、抑癌基因（抗癌基因）,最早由A.Knudson Jr.提出 细胞内一类抑制肿瘤发生、生长的基因，最近又发展为指能对抗癌基因作用的基因。在生物体内与癌基因功能相抵抗，共同保持生物体内正负信号相互作用的相对稳定。肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活都是癌化过程的一部分。,转录调节因子：如Rb、p53负调控转录因子：如WT周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）：如p15、p16、p21信号通路的抑制因子：如ras GTP酶活化蛋白（NF-1）、磷脂 酶（PTEN）DNA修复因子：如BRCA1、BRCA2 与发育和干细胞增殖相关的信号途径组分：如APC、Axin,抑癌基因分类,一些抑癌基因的功能,确定抑癌基因在理论上需要满足的三个基本条件,1、在恶性肿瘤相应的正常组织该基因必须正常表达。2、在恶性肿瘤中，该基因有功能失活或结构改变或表 达缺陷。3、将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞中，可部分或完全改变其恶性表现。,1、Rb基因（视网膜母细胞瘤基因）Rb（retinoblastoma gene）是第一个被克隆的抑癌基因。1986年，美国的三个实验室分别独立的克隆了该基因。Rb基因，全长约200kb，含27个外显子，26个内含子，外显子大小不同短的31bp，长的有19kb，转录的mRNA有4.7kb,编码928个氨基酸，分子量是105-110kD的核内磷酸化蛋白。Rb具有DNA结合活性，表明其能够参与某些基因的调节。,（一）几种重要的抑癌基因,Rb基因的磷酸化状态是Rb基因调节细胞生长分化的主要形式。调节Rb功能最主要的磷酸化事件在G1和S期交界处。磷酸化的Rb与细胞内蛋白结合形成复合物的能力丧失。如，Rb在非磷酸化状态下可以与E2F结合，并抑制其活化基因表达的功能。磷酸化的Rb不能与E2F结合。E2F与DP1蛋白形成异二聚体活化一系列由G1期进入S期所必需的基因的表达。,（1）Rb基因的生物学活性,DP,E2F,DNA synthesis-related genes,E2F,E2F,P,P,P,P,E2F,E2F,E2F,E2F,（二）Rb基因异常与肿瘤,Rb基因异常主要表现为等位基因缺失和基因突变。最初，在视网膜母细胞瘤中发现，后来在多种肿瘤中均发现该基因的异常。其基因异常多发生在13-17外显子上。在小细胞肺癌中异常为50%，骨肉瘤47%，乳腺癌32%.,二次突变假说 1971年，Knudson在研究视网膜母细胞瘤时提出了“二次突变”假说。假说认为，在有遗传倾向的的病人体内所有干细胞和体细胞都存在一种突变，在此基础上，任一视网膜母细胞若再出现第二次突变，即可导致肿瘤发生。,（a）散发性Rb发生较晚，一般只危及一眼；（b）遗传性Rb往往危及双眼，3岁左右发病形成多个肿瘤,2、p53 基因,1979年，发现SV40转化的细胞中p53与SV40-large T抗原结合，而被误认为癌基因，直到1989年，才被证实为抑癌基因,P53基因于1979年被发现；1993年被Science杂志评为明星分子。截至，PubMed上以p53作为关键词检索到的文献已经多达55713篇.,临床上，超过50%的肿瘤其p53有异常。,N,C,100-300 AA DNA结合域,调节domain301-393,1-99,p53 protein,p53基因全长20kb，定位于人类染色体17p13.1，由11个外显子组成，编码393个氨基酸组成的53kd的核内磷酸化蛋白，具有蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质结合的功能。,（1）p53基因的结构,（2）p53基因生物学特性,p53蛋白是细胞生长周期中的负调节因子，在G1/S期起作用，在细胞周期调控、DNA修复和诱导细胞凋亡等方面均具有关键性作用。,p53,Bax,P21（细胞周期素依赖激酶抑制剂-1A）,Cell cycle arrest 细胞周期停滞,Apoptosis,MDM2（小鼠双微体扩增基因2）,P14arf(p14可变阅读框基因),Many factors(主要是造成基因组完整性的损伤),GADD45（生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45）,More than 100 proteins,+,+,+,-,-,+,（3）p53 基因分型,p53 基因分为野生型和突变型，它的表达产物也分为野生型和突变型 野生型p53极不稳定，半衰期仅为数分钟，并具有反式激活功能和光谱的抑制肿瘤的功能。突变型p53具有癌基因的功能，促进癌细胞的恶性转化。,（4）p53 基因异常与肿瘤,p53基因缺失或突变已被证实是绝大多数肿瘤发生的原因之一 肿瘤中p53的突变形式：点突变、缺失突变、插入突变、移码突变、基因重排。绝大多数突变集中在第5-8外显子处，即“热点突变”(以175、248、249、273、282位点突变最高，不同种类肿瘤不同）。少数突变存在于其它外显子或内含子的剪切位点上。p53大多数点突变是引起蛋白功能改变的错义突变，少数是无义突变或终止码突变。,3、NF1基因(多发性神经纤维瘤基因1型)4、WT1基因（肾母细胞瘤基因1型）,四、癌基因与抑癌基因协同致癌作用,由于恶性变是多步骤的过程，恶性肿瘤形成以后癌细胞经过不断的突变和选择，其恶性行为逐步升级即演进（progression）（包括侵润、转移及治疗过程中发生的抗放射性、抗药性），理应涉及许多基因的的激活并参与作用，但目前仅变恶性变而言，需要多少个肿瘤基因参与，还不够清楚。至于恶性肿瘤形成以后，哪些基因产物与恶性肿瘤的演进过程有关更是基本上空白的领域。,单个肿瘤基因的致癌作用，仅仅在动物体建株细胞中得到证明，以具有突变的 ras基因为例，仅在小鼠NIH3T3，大鼠RAT-1，中国仓鼠（CHEF）等成纤维细胞中能致使恶变，最近有报道用小鼠乳腺上皮细胞株同样可作为受体细胞。必须指出：过去不少人指责NIH3T3是已经超越恶性变最早期阶段、染色体核型不正常的细胞，因而用于分离肿瘤基因不可靠。实际上，这种看法还不全面，应该说所有上述列举的细胞，均属建株的细胞，已具有永生化（immoutalization）的特征，演化到恶性变的第一个台阶，因此用它的作为受体细胞，可以说明某些原瘤基因已被激活，但是并不等于人体肿瘤中激活肿瘤基因仅限于这几种。根本的原因是，除上述细胞均非“正常”细胞以外，DNA转染技术本身也有很大局限性。,(一)单个肿瘤基因的作用,两类肿瘤基因的协同作用，仅在啮齿类原代培养细胞系统得到了证明。在原代培养成纤维细胞（大鼠、金仓鼠）中，细胞恶变需要两大类肿瘤基因参与作用，一类是促使细胞永生化，包括c-myc，N-myc，p53AdEla、EBV的EBVA-2，SV40T等；第二类是促使细胞形态学出现恶变特征，及软琼脂中生长等，包括Ha-ras，Ki-ras，AdElb，PomT（多瘤病毒中T基因）等。上述肿瘤基因包括某些细胞本身的肿瘤基因和外源性病毒的某些片段。只有两类肿瘤基因协同作用，才能使细胞完全恶变，不仅在体外显示恶性特征，而且能在裸鼠体内形成肿瘤。,(二)两类肿瘤基因的协同作用,(三)人体细胞系统肿瘤基因的作用在人体细胞中，上述两类肿瘤基因的协同作用，仍不足以引起细胞恶变。例如，突变的ras基因和myc基因并不能使人成纤维细胞或造血细胞恶变，这提示，应考虑到几种可能性：1.可能尚需其他肿瘤基因的参与使人体细胞恶变，除上述两类肿瘤基因，还需要其它肿瘤基因的参与，包括生长因子或受体基因的改变等。2.可能尚需抗癌基因的失活或丢失，要使人体细胞恶变，激发的肿瘤基因需要在另一类基因（抗癌基因）发生失活或丢失的条件下才能发挥作用。3.可能尚需细胞内基因组遗传稳定性受破坏，要使激活的肿瘤基因在人体细胞恶变中发挥作用，需要一个前提，即细胞内基因组的遗传稳定性受到破坏，这种情况可能由化学致癌物或病毒所引起。,对癌基因与抗癌基因的评论,如果说癌基因是一个涵义混乱不确切的命名，抗癌基因是同样的模糊不清所谓癌基因与抗癌基因都是一大类控制细胞生长和分化的基因，对其单个基因来说，它的产物所具有的功能因细胞种类甚至细胞发育阶段而异,1癌基因与抗癌基因的相对意义:同一种癌基因及其产物，在不同细胞中可起完全 相反的作用,最典型的例子是ras基因及其产物p21。在成纤维细胞中已有充分证据说明，微量注入p21蛋白能使细胞迅速进入S期和开始分裂。人ras基因可使成纤维细胞和某些上皮细胞恶变。但对点突变的嗜铬细胞瘤pc12细胞，将ras基因引入或微量注射p21使恶性细胞停止分裂并开始分化。src基因对鸡成纤维细胞中的致癌作用是确定无疑的，但在胚胎发育过程中，src基因的表达神经系统的分化密切相关，估计这样的例子可能不尽是个别的,从生物学意义上来说，ras基因对成纤维细胞来说是癌基因，对交感神经切来源的pc12来说是抗癌基因。同一基因的产物，是促进生长或抑制生长，是抗癌还是致癌，似乎不取决于该基因的本身，而决定于细胞类别的差异。同时提示不同细胞中以ras基因产物的效应系统不同，因此最后的生物学功能也不同。,2.促进和抑制生长物质的双重性,顾名思义，应将生长因子列入癌基因的范畴，而生长抑制因子则应属抗癌基因之列。事实上，生长因子对不同细胞的作用差别很大，除了受体的因素外，生长因子既可促进细胞生长，也可抑制细胞生长。同样，生长抑制因子既可抑制细胞生长，也可促进细胞生长。因此，不区别细胞的种类即判断哪些基因是促进或抑制生长，显然是不合理的,3肿瘤是一种异常生长,早在上一世纪，Virchow已提出肿瘤是一种异常生长的疾病。癌细胞是一种以自主的，带有分化缺陷的持续生长的细胞癌基因与抗癌基因的研究，尤其是前者，从基因水平揭开了控制细胞生长和分化的物质基础，应该既不受癌基因或抗癌基因的概念所束缚，同时也充分利用上述研究的大量材料，来揭示肿瘤发生的机制,第二节 肿瘤的基因治疗,以基因为靶点的治疗（Gene-targeted therapy），将遗传物质导入人体组织或细胞所进行的疾病的治疗。,目的基因及其作用,一、调节机体免疫1、增加肿瘤的免疫原性。2、提高刺激信号的表达。3、利用肿瘤特异性抗原研制肿瘤疫苗（肿瘤特异性抗原的制备）:如脑癌疫苗、肾癌疫苗和宫颈癌疫苗等,肿瘤基因治疗的策略,二、肿瘤细胞与正常细胞差异表达基因1、抑癌基因基因治疗 将抑癌基因通过各种途径导入肿瘤细胞，重建失活的抑癌基因功能，恢复细胞正常生长表型，或诱导细胞凋亡，从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。,p53基因治疗：2003年，中国开发的重组人p53腺病毒注射液 Gendicine(今又生)上市，2007年4月，美国开发的Advexin开始III期临床研究的疗效分析而进入上市审批程序。,2、抗血管生成治疗 肿瘤的生长与正常的组织的另一个特点是其生长依赖新生血管形成。3、自杀基因基因治疗 将自杀基因单纯胞疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-TK）导入肿瘤细胞，能将药物前体ACV或GCV转化为对细胞有毒的代谢产物，从而特异的杀伤肿瘤细胞。,基因导入的方法,（一）物理/化学方法1、裸露DNA直接注射。注射gene gun2、脂质体共转化。体外细胞转化。3、受体介导的基因导入。病毒载体。（二）病毒载体系统,