病毒鉴定的方法-科四第5组.ppt
病毒鉴定的方法,12科四第五组：黄昭媛 万 敏 李晓塽 陈泽群,病毒的检测手段和方法在不断发展和改进，但无论是什么样的方法，病毒所共有的两个特性而发展起来的：一是病毒的侵染性。二是病毒作为核蛋白的特性，也就是病毒理化性质。,病毒鉴定的方法：,1、电子显微镜检测法2、电镜复染检测法3、免疫电镜检测法4、血清学检测法5、酶标免疫吸附法6、基因检测技术7、蛋白指纹图谱,1、电子显微镜检测法 电子显微镜技术是最直接，最准确的检测病毒的手段，它可以直接看到病毒的形态结构、存在与否，所以在进入了分子水平的今天它仍然有着不可替代的作用。原理：电子显微镜以电磁波为光源,将感病植物组织制成检测样本,利用短波电子流,在电子显微镜下观察,可根据病毒的形态、大小、内含体以及染病组织超微结构等诊断病毒的种类。,返回,2、电镜负染检测法 电镜负染技术是20世纪60年代开始使用于英国试验室，其图像如同一张照相的底片，因此人们习惯地称为负染色，电镜负染技术也就由此而生。原理：一些重金属离子能绕核蛋白体四周沉淀下来，形成一个黑暗的背景，在核蛋白体内部不能沉积而形成一个清晰的亮区，由此辨别病毒。,返回,3、免疫电镜检测法 免疫电镜技术是将免疫学原理与电镜负染技术相结合的产物，在电镜制样过程中，于铜网上先铺展一层细胞色素A，稍后再添加一滴抗体，多余液滴用滤纸吸掉，最后点上一滴抗原和染液，由于细胞色素A的作用，减少了样品即抗体、抗原的表面能力，能形成均匀的涂层。原理：在电镜制样过程中，病毒颗粒不能集中的沉积在有效的电镜视野内，而容易造成电镜观察时的疏漏，免疫电镜法利用了抗体、抗原的亲和性与吸附性的这一特点，使病毒能较集中地沉集在有效视野内，从而便于电镜下的观察，提高了检测几率。,返回,4、血清学检测法 动物受其致病细菌、病毒侵染后，动物体内血液中的球蛋白发生变化而产生抗体，引起动物产生抗体的物质简称为抗血清。由于不同病毒产生的抗血清都有各自的特性,因此可以用已知病毒的抗血清来鉴定病毒种类。原理：病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白是一种很好的抗原,血清中的抗体能与同系的抗原在体外特异的结合，使抗原失去活力。,返回,5、酶标免疫吸附法 该方法最早用于动物病毒的检测，近二三十年才应用于植物病毒的检测，并作为病毒的定量方法广泛应用于病理、免疫学的研究和生产实践中，对病毒进行快速检测。此法的最大优点是灵敏度高，很多的病毒因其浓度太低或某种抑制剂的干扰，常规血清学方法检测不出时，此法就显示出独特的优越性。原理：将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入酶标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。,返回,6、基因检测技术 基因检测技术对病毒的检测已经达到分子水平，其灵敏度和特异性是任何生化方法的检测所不能比拟的，同时可以省略大量的病毒提纯和血清的制备工作。原理:（1）分子探针杂交检测技术，利用一定序列的核苷酸合成探针，通过分子杂交技术，检测出供试样品中与之相补的碱基序列。（2）PCR技术是通过体外扩增可以使供试样品中的目的基因片段很快扩增，使之达到了对即使是病毒含量极低的样品，也能灵敏准确地得到定性的结果。,返回,PCR技术：原理：PCR技术是一种在体外将特异性DNA序列进行高效扩增的方法。PCR扩增DNA片断的特异性是由两个人工合成的寡核昔酸引物的顺序决定的,引物位于靶DNA的两侧,并分别和相对DNA链互补。步骤:将待扩增标本(靶DNA)在高温下变性,双链解离;降低温度,使两引物结合到靶D NA上,两个引物与靶DNA解链后的正负链互补;在合适温度条件下,在DNA多聚酶的催化下,引物引导DNA合成。,PCR技术：运用：A、用于遗传性疾病，如镰状红细胞贫血的诊断；B、用于艾滋病的检测：目前艾滋病的诊断主要采用血清学方法检查抗体,用PCR技术可在HIV感染早期血清未出现抗体之前于血清中测得HIV-DNA,也可从病人外周血白细咆中测得极微量HIV-DNA。C、用于乙型肝炎的检测；D、用于轮状病毒的检测:轮状病毒为婴幼儿急性病毒性胃肠炎的主要病原,PCR用于检测粪便中的轮状病毒比核酸杂交法,敏感性提高5000倍。,返回,7、蛋白指纹图谱法 原理：不同病毒蛋白通过一维sDs一PAGE分离能形成各自独特的蛋白质带型(或指纹图谱)。病毒在感染细胞内繁殖时，用高浓度NaCI特异抑制感染细胞自身的蛋白合成，分离病毒蛋白后进行一维sDs一PAGE即可形成蛋自带型(或指纹图谱)，将待测病毒蛋白指纹图谱与电脑内病毒蛋白指纹图参考软件相比较即可鉴定未知病毒。步骤:(1)培养病毒经抑制宿主细胞合成后进行同位素标记。（2）sDs一PAGE分离病毒蛋白。（3）通过胶扫描对病毒蛋白指纹图谱定位。（4）抽提蛋白质且以数字的形式将蛋白指纹图存入电膊硬盘，最后将未知病毒蛋自指纹图与电脑参考指纹图进行最佳配对比较鉴。,返回,感谢您的关注!,
