氨基酸的薄层层析-分离鉴定氨基酸混合液.ppt
如何分离鉴定氨基酸混合液？,生物化学与分子生物学实验教学中心,氨基酸的薄层层析(Thin layer chromatography of amino acids),生物化学与分子生物学实验教学中心,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验目的,掌握薄层层析法的一般原理。掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,层析技术,概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的。特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯分，也可用于大量物质的分离纯化和制备。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,层析的基本过程,组分A组分B,+流动相,固定相,吸附溶解结合等,解除上述作用,反复进行,移动速度不同,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,层析法的分类,气相层析（以气体为流动相的层析法）液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法）1.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析 2.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析 3.离子交换层析 4.凝胶层析：柱层析、薄膜层析 5.亲和层析,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验原理,1.薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,2.氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。,实验原理,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,茚三酮反应(ninhydrin reaction),09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验原理,3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率Rf值（rate of flow）来表示。层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,实验材料,吸附剂：硅胶粘合剂：0.5%的羧甲基纤维素钠氨基酸的异丙醇溶液 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）分析样品：氨基酸混合液,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,器材,层析板、尺子、铅笔烧杯、量筒喷雾器、吹风机毛细管、层析缸药匙烘烤箱,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,操作步骤 薄层板的制备,1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。4、活化 70烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,操作步骤 点样,2cm,1cm,1、位置：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距1cm。2、用毛细管分别吸取氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。3、加样后原点扩散直径不超过2mm。4、待点样点干后再重复点一次。,Ala Arg Gly Mix,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,操作步骤 展层、显色,将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干或在85下烘干，即可显出各层斑点。,Ala Arg Gly Mix,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,注意事项,1.切勿用手直接接触薄层板面。2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，易造成斑点过大，互相交叉或拖尾。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,Rf=,斑点至原点距离,溶剂前缘至原点距离,结果计算,小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的 值。根据值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。,09年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,复习思考题,氨基酸薄层层析的基本原理是什么？按原理分类，层析分为哪些？主要原理各是什么？,生物化学与分子生物学实验教学中心,Thank You!,
