常用核酸提取技术介绍.ppt
常用核酸提取技术介绍,核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。,前 言,核酸的存在形式核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在；真核生物的染色体DNA为双链线性分子；原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA有时为单链环状分子；病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。,利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异提取DNA、RNA，去除其他成分。,核酸提取的基本思路,提取纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。,核酸提取的原则,核酸提取应达到的要求：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。,核酸提取应注意的问题：尽量简化操作步骤，缩短提取过程。减少化学因素对核酸的降解。减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解。,破碎,提取,纯化,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,细胞裂解方式分类：,物理方式：煮沸法、玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法、匀浆法化学方式：表面活性剂（SDS法）、碱裂解法生物方式：酶法（溶菌酶、蛋白酶K等）,浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：,利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,常见样本提取方法总结：,吸附材料结合法：,硅质材料阴离子交换树脂磁珠,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,1、浓缩煮沸裂解法：（以HBV为例）50ul浓缩液+50ul血清12000rpm 10min 弃上清加入20-50ulDNA裂解液吹打混匀 100 10min 12000rpm 5min 取上清加样浓缩液主要成分：聚乙二醇（PEG）、NaCl裂解液主要成分：Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS,常见核酸提取方法简介,聚乙二醇（PEG）,HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH,n4PEG为有机聚合物，无毒，亲水性强，相对分子量为6K-20K；PEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液pH值和温度等因素的影响，采用该方法可将病毒量浓缩10倍以上。,裂解液裂解原理：Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55100）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；,特点：操作相对简单，成本低，但抗干扰能力差，不利于自动化操作。,原理：标本经裂解消化后，释放出核酸，核酸与磁珠结合(特异性的和非特异性的)利用磁珠分离仪器将核酸提取纯化，作为PCR反应的模板。磁珠其内核为氧化铁，直径0.5-50um不等，一般广泛应用于DNA、RNA纯化的磁珠为硅质膜磁珠。磁珠在高盐条件下与核酸结合，而在低盐环境下被洗脱，可用于全血、组织、细菌、病毒、植物的核酸纯化。,2、磁珠吸附法：（以HBV为例）,第一步：细胞的裂解：破碎细胞，并向溶液中加入磁珠。,第二步：结合核酸：pH较低，在高盐环境下，硅胶磁珠带正电荷，选择性的与优化试剂中的核酸结合。,主要步骤：,第三步：洗涤：用洗涤液将非核酸成分冲洗分离（为清洗干净该步骤可以重复多次）。,第四步：核酸的洗脱：pH升高，在低盐环境下，核酸被洗脱下来。,特点：特异性好，抗干扰能力强，易于实现半自动和全自动操作。,原理：采用硅胶膜吸附核酸，而对其他生化组分如蛋白质、多糖、脂类既不相亲也不吸附，因而可得到纯化的核酸。,3、硅胶柱吸附法：（以肿瘤标本为例）,样品,化学裂解,洗脱,洗涤,主要步骤：,注意事项：,二甲苯有毒且对后续试验有影响，一定要用乙醇洗干净。乙醇挥发时间一定不要打折扣。加热时要将样品封好口，以免过热时管子盖崩开进水。,核酸提取的质量控制,DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。,纯双链DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7时表明有蛋白质或酚污染；2.0时表明可能有异硫氰酸残存）,核酸样品的保存：核酸保存的主要条件是温度和介质 温度：4（5）最佳和最简单-70是长期保存的良好温度，为一次性保存-20保存 保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0,谢谢！,
