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第四节 基因工程菌培养与发酵,什么是基因工程菌？培养和发酵基因工程菌的目的是什么最常用的基因工程药物表达系统是什么？基因工程菌的发酵受到哪些条件的影响？,一、概念,工程菌是采用现代生物工程技术加工改造，被转入了外源目的基因的新型微生物具有多功能、高效和适应性强等特点。,治理海洋石油泄漏生产基因工程药物培养和发酵的目的：外源基因能高水平表达，能获得大量外源基因产物【其实是指蛋白质的产生，表现出对应的作用】,最常用的基因工程药物表达系统（工程菌体系）大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞,二、工程菌生长繁殖需要的条件,良好的物理环境:主要有发酵温度、PH值、溶氧量等。合适的化学环境:适宜工程菌生长代谢所需的各种营养物质的浓度,并限制各种阻碍生长代谢的有害物质的浓度,三、基因工程菌常用的发酵方法,1、批式培养 指营养物和工程菌株一次加入进行培养,直到培养结束放出,中间除了空气进入和尾气排出、酸碱调解PH值外与外部没有物料交换。传统的生物制品发酵多用此过程。,2、流加式培养 是一种发酵过程中优化化学环境的一种有效方法,在批式培养基础上,改善批式培养过程中由于营养物质的消耗造成的重组细胞营养不足,调整了工程菌所处的生长环境,使工程菌一直处于最佳状态,工程菌在保存、发酵过程中不稳定，成为制约基因工程转变为生产力的关键之一。,四、工程菌的稳定性,外在表现：得不到表达产物、或达不到要求产量。本质：质粒不稳定；表达产物不稳定。内在表现：质粒丢失；重组质粒DNA片段脱落。,1、工程菌不稳定性的表现,质粒丢失：由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。,重组质粒上一部分片段脱落：表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。表达产物不稳定：人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。,影响工程菌稳定性的因素：（1）质粒结构：质粒稳定区受到影响，重组质粒上有重复序列等。（2）宿主：宿主中重组基因的完整性、重组时有关基因的变异等。（3）环境因素：高温、去垢剂、某些药物(如利福平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失。,（1）组建合适载体 构建质粒时，插入一段特殊的DNA片段或基因，使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。（2）选择适当宿主 在选择宿主时，须确定其遗传特点。重组质粒在大肠杆菌中较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。,2、解决工程菌不稳定的对策,（3）施加选择压力 a 抗生素添加法 通常在重组质粒上含抗药性基因。转入不耐药的宿主后，工程菌获得了抗药性。发酵时，培养基中加入抗生素，可阻止丢失质粒的非生产菌生长。,b 抗生素依赖变异法 诱变使宿主成为某抗生素的依赖性突变株，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因。发酵生产时，不向培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。,c、营养缺陷型法 诱变使宿主成为营养缺陷型，将相关基因插入到重组质粒中，选择基础培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。,（4）控制基因过量表达 外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失。可采取两阶段培养法。,（5）控制培养条件 众多环境因素中，培养基组成、培养温度、菌体的比生长速率尤为重要。对一个已经组建完成的克隆菌来说，选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。,（6）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。,五、基因工程菌生长代谢的特点,菌体的生长通常用比生长速率来表示。工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。,大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。,（一）菌体的生长与能量的关系,碳源物质是组成培养基的主要成分当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用,分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。,（二）菌体生长与前体供应的关系,在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。,六、基因工程菌发酵,（一）基因工程菌的培养过程 通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件如温度、pH、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响;,通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。,菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养 原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制 微生物工业发酵过程简图,（二）基因工程菌的发酵工艺,基因工程菌的发酵不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。,工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有：培养基的影响接种量的影响温度的影响溶解氧的影响热诱导时机的影响pH的影响,培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。,常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。,不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多,在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子，磷浓度不同，影响菌体生长。,接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达。,接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。,温度的影响,温度对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。温度影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制。,溶解氧浓度（DO）的影响,对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率。,发酵时，随DO浓度的下降，细胞生长减慢。外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。维持较高的DO值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成。,采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量。,热诱导时机的影响,一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。要求在2min内让罐升温达到42。升温时间太长，会降低外源蛋白表达量，也给提取纯化增加困难。,pH的影响,pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。,如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳pH在6.87.4左右;培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳pH为6.06.5。,（三）基因工程菌的培养设备,微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标应用发酵罐大规模培养基因工程菌是为了获得最大量的基因表达产物。,发酵罐的组成有：发酵罐体保证高传质作用的搅拌器精细的温度控制和灭菌系统空气无菌过滤装置残留气体处理装置参数测量与控制系统培养液配制和连续操作系统。,发酵罐要求：提供菌体生长最适生长条件，培养过程不得污染，保证纯菌培养，培养及消毒过程不得游离异物，不能干扰细菌代谢活动等。,补充：菌种保藏,菌种是国家的重要资源。任务:不死亡、不污染、不退化。1980年，中国微生物菌种保藏委员会成立。,一、菌种保藏的意义,原理：人工创造条件使微生物的代谢尽量降低，以减少变异。一般可通过限制营养、缺氧，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态。,二、菌种保藏原理和方法,（一）斜面冰箱保藏 4冰箱保存。保存期1-3月。,（二）沙土管保藏法 适合于产孢子或芽孢的微生物。保存期1年左右。,（三）菌丝速冻法 不产孢子或芽孢的微生物可用甘油菌丝速冻法。保藏温度为20，为避免损伤致死，需甘油作保护剂。甘油最终浓度为25。,（四）石蜡油封存法 向菌种斜面上，倒入一层灭菌石蜡油，量高出斜面1cm，保存冰箱中。适于不能利用石蜡油作碳源的微生物。保存期约1年。,（五）真空冷冻干燥保藏法 基本原理：在较低温度下(-18)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。菌种可保存5年左右。,（六）液氮超低温保藏法 是近几年才发展起来的，国外已较普遍采用，适用范围最广。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。,（1）原理 液氮的温度可达-196，远远低于新陈代谢作用停止的温度(-130)，菌种代谢活动停止，化学作用消失。,（2）操作 a 安瓿管 需能承受大温差而不至于破裂，加棉塞后灭菌，烘干后备用。b 菌种准备及分装 超低温冷冻过程需要保护剂。常用保护剂为10甘油，制备好菌液后，加入安瓿管，装量0.21mL。,c 冻结 关键是把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使胞内水通过膜渗出，而不形成冰晶而伤害细胞。美国ATCC先将菌液降到0，再1/min降低到35，再放入液氮罐的气相中。因液氮蒸发导致温度上升，冰晶状态发生变化而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮残存量，定期补加。,d 重新培养 将安瓿管从冰箱中取出，室温迅速解冻，升温至0时即可打开安瓿管，移到适宜的斜面上培养。,三、国内外主要菌种保藏机构,国际机构：ATCC American Type Culture Collection.Rockvill Maryland,U.S.A.美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市。CSH Cold Spring Harbor Laboratory.U.S.A.冷泉港研究室，美国。,NIH National Institutes of Health.Bethesda,Maryland,U.S.A.国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达。NRRL Northern Uti1ization Research and Development Division,U.S.Department of Argculture,Peoria,U.S.A.美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。,IAM Institute of Applied Micribiology.University of Tokyo,Japan.日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。IFO Instltute for Fermentation.Osaka,Japan.发酵研究所，日本大阪。,KCC Kaken Chemical Company Ltd.Tokyo,Japan.科研化学有限公司，日本东京。NCTC National Collection of Type Culture.London,United Kingdom.国立标准菌种收藏所，英国伦敦。,国内机构：中国微生物菌种保藏管理委员会(China Committee for Culture Collection of MicroorganismsCCCMS)。下设六个菌种保藏管理中心。1、普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)：中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌，细菌；中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS-)：病毒。,2、农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)：中国农业科学院土壤肥料研究所，北京(1SF)。3、工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)：轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京(IFFl)。4、医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)：中国医学科学院皮肤病研究所，南京(1D)：真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京(NICPBP)：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。,5、抗生素菌种保藏管理中心(CACC)：中国医学科学院抗生素研究所，北京(1A)。四川抗生素工业研究所，成都(STA)：新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄(IANP)：生产用抗生素菌种。6、兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)：农业部兽医药品监察所，北京。,
