食品卫生微生物学检查.ppt
第六章 食品微生物学检验,第一节食品中菌落总数的测定,第一节食品中菌落总数的测定,菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后,所得1mL(g)或1cm2面积检样中所含菌落的总数。,一、菌落总数测定的意义,判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。预测食品存用的期限长短。了解细菌在食品中的繁殖动态。,二、菌落总数测定的方法,本标准与GB/T 4789.2-2008相比，主要修改如下：修改了标准的中英文名称；修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了培养基和试剂；删除了第二法 菌落总数PetrifilmTM 测试片法。,第一节食品中菌落总数的测定,检测标准：GB/T 4789.2-2010,平板菌落计数法:,(一)检验步骤(程序)：,（二）操作步骤,1样品的稀释1.1 固体或半固体样品：称取检样25g 225mL灭菌磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/mim10000r/min均质12min，或无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打12min 制成110的样品匀液1.2 液体样品：吸取检样25mL 225mL灭菌磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶，(瓶内预置适量的玻璃珠)，充分混匀 制成110的均匀稀释液,1.3 用1mL灭菌吸管 吸取110稀释液1ml 注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内 振摇试管混合均匀 制成l100的稀释液。1.4 另取1mL灭菌吸管，按以上和步骤操作顺序，制10倍递增稀释液。1.5 选择2-3个适宜稀释度，各吸取1mL分别置于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿。,（二）操作步骤,1样品的稀释,1.6 稀释液移人平皿后，将凉至46左右的平板计数琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿混合均匀。,（二）操作步骤,同时将平板计数琼脂培养基倾人加有1mL稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。,1样品的稀释,样品稀释及做平板,1mL,1mL,1mL,1mL,1:10,1:1000,1:100,1:10000,1mL,1mL,1mL,加入46平板计数琼脂培养基1520mL,25g/ml样品,生理盐水,225ml,均质12min,注意：每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。,（二）操作步骤,1样品的稀释,2.培养 待琼脂凝固后翻转平板,置(361)恒温箱内培养(482)h,水产品(301)恒温箱内培养(723)h。,（二）操作步骤,注意：如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转培养。,以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示3.1 选菌落数在30300CFU，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。,（二）操作步骤,3.菌落计数,（二）操作步骤,3.2 其中一平板有较大片状菌落生长时，不宜采用，应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落数不到平板的一半，而其余一半中菌落分布均匀，即计算半个平板后乘以2，代替一个平板菌落数。3.3 当平板上出现菌落间无明显 界线的链状生长时，则每条单链作 为一个菌落计数,3.菌落计数,（二）操作步骤,4.结果的表述,4.1.1 若只有一个稀释度平板的菌落数在适宜计数范围内，计算两平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。,4.1 菌落总数的计算方法,（二）操作步骤,4.结果的表述,4.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（1）计算：N=C/(n1+0.1n2)d-(1)式中：N-样品中菌落总数；C-平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1-第一个适宜稀释度平板数；n2-第二个适宜稀释度平板数；d-稀释因子（第一稀释度）。,4.1 菌落总数的计算方法,（二）操作步骤,4.结果的表述,N=C/(n1+0.1n2)d=232+244+33+35/2+(0.12)10-2=544/0.022=24727数据“四射五入”后，表示为25000或2.5104,4.1 菌落总数的计算方法,示例,4.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其它平板可记为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释度计算。4.1.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。,（二）操作步骤,4.结果的表述,4.1 菌落总数的计算方法,4.1.5 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。4.1.6 所有稀释度的平板菌落数均不在30300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算,（二）操作步骤,4.结果的表述,4.1 菌落总数的计算方法,4.2.1 菌落数在100以内时，按“四射五入”原则修约，采用两位有效数字报告。4.2.2 大于或等于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数采用“四射五入”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示。4.2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。4.2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。4.2.5 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告,（二）操作步骤,4.结果的表述,4.2 菌落总数的报告,复习题,1、什么是菌落总数？2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意义？3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。4、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？,思考题,第二节 食品中大肠菌群计数,一、大肠菌群概述,大肠菌群：指一群在36条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。主要来源于人畜粪便，作为污染指标评价食品卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。大肠菌群的组成:大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。,大肠菌群或大肠杆菌：粪便污染的指标菌,二、大肠菌群的测定意义,以大肠菌群作为粪便指标菌原因：,在粪便中数量最大；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；检测方法简便容易。,大肠菌群检验的意义（1）判断食品中否受到粪便污染。（2）有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。,二、大肠菌群的测定意义,三、大肠菌群的生物学特性,1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气 3.培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。,EMB平板照片及原理,麦康凯琼脂平板Age of culture is 24 h,四、大肠菌群检验方法及操作方法,采用标准：GB/T 4789.32010第一法 大肠菌群MPN(most probable number)计数法第二法 大肠菌群平板计数法,煌绿乳糖胆盐肉汤,（一）检验程序,大肠菌群MPN计数法,样品的稀释,初发酵试验,复发酵试验,大肠菌群最可能数（MPN）报告,LST:月桂基硫酸盐胰蛋白胨,10-1,各加入1ml,月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤管,初发酵试验,检样稀释,检样量1g/ml,检样量0.1g/ml,检样量0.01g/ml,复发酵试验,煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管,查MPN表报告结果,10-3,10-2,10-4,1mL,1mL,1mL,361培养24h2h48h2h,产气管：用接种环移种一环,未产气管,大肠菌群阴性,产气为阳性未产气为阴性,361培养24h2h48h2h,(二)操作步骤,1样品的稀释:同菌落总数的测定,2初发酵试验,选择3个稀释度，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL(如接种量超过1mL，则用双料LST)，(361)恒温箱培养(242)h，观察倒管内是否产气，如未产气，继续培养至(482)h，记录产气的LST肉汤管数。,(二)操作步骤,如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，进行复发酵试验。,(二)操作步骤,3复发酵试验,用接种环从所有(482)h内发酵产气的LST肉管中分别取培养物一环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，(361)恒温箱培养(482)h，观察产气情况，产气者，记为大肠菌群阳性管,(二)操作步骤,4大肠菌群最可能数（MPN）的报告,根据大肠菌群阳性管，检索MPN表（见附表），报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。,大肠菌群平板计数法,（一）检验程序：,样品的稀释,平板计数,平板菌落数的选择,大肠菌群平板计数的报告,证实试验,(二)操作步骤,1样品的稀释:同菌落总数的测定,(二)操作步骤,2.平板计数2.1 选取23个适宜连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿（1mL）。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。2.2 将1520mL冷至46的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿，旋转平皿混匀，琼脂凝固后，再加34mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于361培养1824h。,3.平板菌落数的选择 选取菌落数在15150 CFU之间的平板，分别计数平板上典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落：紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。,(二)操作步骤,4.证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361培养2418h，观察产气情况。凡GBLB肉汤管产气，可报告为大肠菌群阳性。,5.大肠菌群平板计数报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以3.中计数的平板菌落数，在乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g(mL)=6.0105CFU/g(mL),1、从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。2、对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。3、挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2个以上的典型菌落或非典型可疑菌落进行接种。4、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。,五、检验注意事项,六、饮用水的大肠菌群检验,GB/T8538-2008饮用天然矿泉水检验方法,复习题,1、什么是大肠菌群？大肠菌群由哪些微生物组成？2、测定食品、饮料等产品的大肠菌群数有什么意义？3、大肠菌群具有哪些生物学特性？4、在大肠菌群数的检验中，要注意哪些事项？5、在水的大肠菌群数检验中，如何进行水样的采集？,
