非衍生化串联质谱法对氨基酸及肉碱检测程序的测量不确定度评估.docx

非衍生化串联质谱法对氨基酸及肉碱检测程序的测量不确定度评估陈月，于月新北部战区总医院生殖医学科辽宁省沈阳市I100oo基金项目：中国人民解放军军队后勤科研重点项目(BLIM9J012),辽宁省自然科学基金指导计划O摘要：目的对本实验室ABSCieXAPl3200MS/MS串联质谱仪及配套的美国PerkinEImer公司试剂在检测新生儿遗传代谢产物(包含氨基酸及肉碱)程序的测量不确定度实行评估，并针对其评估结果的意义进行讨论.方法根据医学实验室测量不确定度的评定与表达中的计算方法，采用批号不同的两种试剂盒对室内质控进行检测，时间各为20个连续自然日，保证在日常标本检测的前、后各进行一次质控品的检测，检测者不固定可随机更换，计算测量更现性引入的测量不确定度；整理卫生部临床检验中心在2018年和2019年的共四次新生儿遗传代谢病串联质谱筛查中的室间质评数据，包含20个氨基酸的室间质评数据、16个酰基肉碱的室间质评数据，计算偏倚引入的测量不确定度；根据测量复现性和偏倚两者各自引入的测量不确定度来计算相对合成标准不确定度以及相对扩展不确定度。最后目标扩展不确定度则采用卫生部临床检验中心下发的新生儿遗传代谢病串联质谱筛查中氨基酸和酰基肉碱室间质评的允许总误差指标。结果LEU>ClT.MET、TYR.CIO、CI2、CI6、C18的相对合成扩展不确定度为11.80%-14.95%(k=2),ALA、PHE、VAL、CO、C2、C3、C4、C6、C8的相对合成扩展不确定度为15.46%-18.47%(k=2),都满足于目标不确定度的范围内,而C5的不确定度略高于目标不确定度，需要另行评估，结论通过非衍生化串联质谱法对氨基酸及肉碱检测程序的测量不确定度实行评估，不仅仅能够验证检验程序在整个检验过程中的检验质量问题并能及时做出相应的改进，而且打破项目参考值的上下限的局限，对实验室的技术人员解读检验数据方面提供了该实验室的范围参考和借鉴，更好服务于临床医生正确的判读报告。关键词：非衍生化；串联质谱法；氨基酸；酰基肉碱；测量不确定度EvaluationofmeasurementuncertaintyfordeterminationproceduresforaminoacidsandcarnitinebynondcrivativetandemmassspectrometryChenYue,YuYuexinDepartmentofReproductiveMedicine,NorthernTheaterGeneralHospital,ShenyangCity,LiaoningProvince110000Abstract:ObjectiveThemeasurementuncertaintyoftheABSClEXAPI3200MS/MStandemmassspectrometerandtheassociatedPerkinElmerreagentsinthelaboratoryinthedetectionofneonatalgeneticmetabolites(includingaminoacidsandcarnitine)wasevaluated,andthesignificanceoftheevaluationresultswasdiscussed.MethodsAccordingtothemedicallaboratory,evaluationandexpressionofuncertaintyofmeasurementofthecalculationmethodofusingbothbatchnumberdifferentkitstotesttheindrqualitycontrol,eachtimefor20consecutivenaturalday,ensurethedailysamplesbeforeandafterthedetectionofaqualityproduct,changedetectionisnotfixedrandom,calculatethemeasurementrepeatabilityintroducetheuncertaintyofmeasurement.ThePMIdatafromfourtandemmassspectrometryscreeningtestsofneonatalgeneticmetabolicdiseasesconductedbytheClinicalLaboratoryCenteroftheMinistryofHealthin2018and2019werecollected,including20aminoacidsand16acylcarnitine,andthemeasurementuncertaintyofbiasintroductionwascalculated.Therelativecompositestandarduncertaintyandtherelativeextendeduncertaintyarecalculatedaccordingtothemeasurementuncertaintiesintroducedbymeasurementreproducibilityandbiasrespectively.Finally,thetotalallowableerrorindexofaminoacidandacylcamitinecompartmentqualityassessmentforneonatalgeneticmetabolicdiseasescreeningissuedbytheClinicalLaboratoryCenteroftheMinistryofHealthwasusedfortheextendeduncertainty.ResultsTheevaluationofthemeasurementuncertaintyofaminoacidandcarnitinedetectionproceduresbynon-derivativetandemmassspectrometrycannotonlyverifytheinspectionqualityproblemsoftheinspectionproceduresinthewholeinspectionprocessandmakecorrespondingimprovementsintime,butalsobreakthelimitationoftheupperandlowerlimitsoftheprojectreferencevalues.Intermsoftheinterpretationoftestdatabylaboratorytechnicians,itprovidesarangeofreferenceandreferenceforthelaboratory,andbetterservestheclinicaldoctorstocorrectlyinterpretthereport.Keywords:non-deriVatization;Tandemmassspectrometry;Aminoacid;Acylcarnitine;Measurementuncertainty根据流行病学调查统计，新生儿患遗传代谢病的几率能达到5.3%匕%在我国，不同地区新生儿遗传代谢病串联质谱筛查发展不平衡，以致实验室质量水平差异显著，因此，室内质量控制和室间质评可作为实验室检测结果准确性和可靠性的一个标尺，更是实验室报告发出的客观依据。依据ISol5189:2012医学实验室质量和能力的要求,在整个检验工程中，每个实验室都应该评估每个用于报告标本被测量值的测量程序的不确定度，整理出适合各自实验室的参考范围，为正确解读报告作为参考。然而，在各类文献中相继出现血常规项目及临床化学检验常规项目的测量不确定度评估的相关报道"5J,但是应用非衍生化串联质谱法对滤纸干血斑氨基酸及酰基肉碱检测程序的测量不确定度评估报道较少。本研究主要对本实验室非衍生化串联质谱法在滤纸干血斑氨基酸及酰基肉碱的检测程序的测量不确定度实行评估。1材料与方法1.1 标本来源均为滤纸干血斑标本。1.1.1 测量复现性引入的测量不确定度评估的标本采用美国PerkinElmer公司非衍生化多种氨基酸及肉碱测定试剂盒。1.1.2 偏倚引入的测量不确定度评估标本采用原卫生部临床检验中心新生儿遗传代谢病串联质筛查中的氨基酸和酰基肉碱室间质评标本。1.2 仪器与试剂ABSCieXAPI3200MS/MS串联质谱仪、孵育振荡器（MBloo-2A）、PE试剂盒和溶剂包（包含萃取液和流动相）、甲醇。1.3 方法1.3.1 测量复现性引入的测量不确定度采用PE试剂盒A和PE试剂盒B分别检测室内质控品各20个连续自然日，每个自然日在日常标本检测前、后各检测I次质控品，检测者不固定可随机更换。13.2偏倚引入的测量不确定度统计原卫生部临床检验中心2018年和2019年新生儿遗传代谢病串联质谱筛查中的氨基酸室间质评数据和酰基肉碱室间质评数据。采用MicrosoftExcel2007软件根据医学实验室-测量不确定度的评定与表达中的计算方法进行统计分析。133目标不确定度选择标准依据卫生行业标准，目标扩展不确定【6口采用原卫生部临检中心新生儿遗传代谢病串联质谱筛查中的氨基酸和酰基肉碱室间质评的允许误差。2 .结果表一非衍生化串联质谱法对氨基酸及肉碱检测程序的测量不确定度评估结果评估项目测最小史性引入的测最不确定度偏倚引入的测砥不确定度()<n<(%)p«ei(%)(k=2)目标不确定度(%)评论(pmo!L)RMSKbaiS)UnACrefJ(bias)ALA1759.31127.227.234.420.734.488.5117.0225.0满足ClT312.7316.385.243.011.233.256.1612.3325.()满足LEU801.1435.674.452.750.692.845.2810.5625.0满足MET371.3120.435.5()3.380.753.466.5012.9925.0满足PHE624.2149.247.893.630.713.708.7217.4325.0满足TYR1163.4362.605.383.751.073.906.6413.2925.()满足VAL960.7273.597.663.570.773.658.4916.9725.0满足CO244.9816.476.723.730.813.827.7315.4630.()满足C2145.929.566.553.980.714.047.7015.3930.0满足C325.761.907.365.400.695.459.1618.3130.()满足C45.960.406.633.910.703.977.7315.4630.0满足C52.750.124.4815.311.2315.3616.0032.0030.()不满足C5DC1330.138.774.676.678.1411.9623.9330.0满足C61330.107.233.901.194.088.3016.6030.0满足CS1.630.127.615.140.975.239.2318.4730.0满足ClO2330.145.923.750.803.847.0514.1130.()满足C124530.224.795.581.325.747.4714.9530.0满足CI627.701.244.483.770.733.845.9011.8030.()满足ClS4350.204.673.380.903.505.8411.6730.0满足注：1为实验室检测平均值3 .讨论新生儿遗传代谢病筛查是公共卫生工作的重要组成部分，是预防和控制出生缺陷的一项关键和有效的措施网。串联质谱检测程序采用滤纸干血斑的标本，在上机前需要对标本进行前处理操作，而且该仪器的检测原理明显不同于常规临床化学检测系统，其性能特征、质量管理尚没有明确标准，因此在新生儿遗传代谢病的筛查和诊断中应用串联质谱法存在不少的问题和挑战。总而言之，实验室在应用串联质谱法检测新生儿遗传代谢病的整个过程中需要对其检验系统的性能特征、质量指标实行研究和评估，不仅仅能够验证检验程序在整个检验过程中的检验质量问题并能及时做出相应的改进，而且打破项目参考值的上下限的局限，对实验室的技术人员解读检验数据方面提供了该实验室的范围参考和借鉴。通过对本实验室质控数据与室间质评数据的统计分析，可以看出应用非衍生化串联质谱法检测氨基酸及肉碱的配套检测程序的测量不确定度会因各个检测项目的不同而有所不同，CIT.LEUxMET、TYR.CIO、CI2、Cl6、C18的相对合成扩展不确定度为11.80%-14.95%,ALAPHE、VALsCO、C2、C3、C4、C6、C8的相对合成扩展不确定度为15.46%-18.47%,都满足于目标不确定度的范围内，充分验证了本实验室串联质谱法的检测系统的稳定性能。实验室根据这些项目的测量不确定度，可以更加全面地分析检测数据，为临床提供更合理的检验报告。举例说明，根据2014年高苯丙氨酸血症诊治共识，本实验室设定PHE的参考范围26100molL,高苯丙氨酸血症的诊断标准为PHE值大于120molL且苯丙氨酸与酪氨酸的比值大于2。如果某一新生儿PHE的检测值为135,高于实验室设置参考上限35个单位，但结合本实验室PHE的相对合成扩展不确定度为17.43%,则该新生儿这次检验结果的分布范围为lll-l59molL,可以解读为该次检测的PHE值虽高于实验室所设参考范围上限，但可能不大于120molL,该检验报告发出可以建议临床重新采集血标本进行一次复查，绝不能够轻易地给予高苯丙氨酸血症的实验诊断意见,这样更能够减轻新生儿家长心理上的负担。如果某一新生儿PHE的检测值为158molL,则该新生儿这次检验结果的分布范围为130-186molL,可以解读为该次检测的PHE值95%的可能大于120molL,若此时苯丙氨酸与酪氨酸的比值也大于2,该检验报告应该高度提示高苯丙氨酸血症，建议临床要进一步确诊。测量不确定度不仅能够验证实验室检测系统的性能，更能够帮助实验室人员更全面谨慎地解读数据，服务于临床。然而对测量不确定度地评估，不应该照搬书本教条，应该根据实验室的实际情况制定自己的分布范围。比如本实验室的C5,偏倚引入的相对测量不确定度为15.36%,满足于目标不确定度范围，但进而计算C5的相对合成扩展不确定度为32%,略高于目标不确定度，表明该项目检测程序的正确度略差，应该在日后的改进方法中对该项目进行性能验证，查找原因。应用非衍生化串联质谱法配套检测氨基酸及肉碱程序的测量不确定度的评估受多种因素影响，首先是该滤纸干血斑标本的不可控性，在上机进行检测前需要进行打孔取样等前处理，新生儿血液标本采集困难，以致血斑上的血量存在分布不均匀，造成重复打孔取样的误差现象；其次在前处理的过程中还有转移加样的操作，即加样误差，两者误差加大了测量更现性引入的测量不确定度。在不确定度评估的整个过程中，还需要注意的是原卫生部临检中心新生儿遗传代谢病串联质谱筛查中的氨基酸和酰基肉碱室间质评活动中所发放的标本里酰基肉碱的浓度过低，低于检测系统的功能灵敏度，更易造成偏倚过大，可能会加大偏倚引入的测量不确定度。正因为这样的考虑，未加入浓度过低的一水平酰基肉碱标本数据进行统计分析。综上所述，通过本实验室的数据统计分析表明，应用非衍生化串联质谱法检测新生儿遗传代谢病筛查程序的测量不确定度实行评估，不仅仅能够客观地验证检测系统的性能及质量指标，并及时地发现检测系统中存在的问题，做出正确的解决方案，更重要的是有助于实验室技术人员正确地解读检测数据及临床医生做出正确地诊断意见。参考文献1VermaIC,PuriRD.GlobalburdenofgeneticdiseaseandtheroleofgeneticscreeningJJ.SeminFetalNeonatalMed,2015,20(5):354-363.叶军.新生儿遗传代谢病筛查发展及诊治规范J中国计划生育和妇产科，2016,8(1)：6-13.3叶圆圆，王薇等.我国新生儿遗传代谢病串联质谱筛查室内质控变异系数分析川.临床检验杂志,2016,34(12):901-903.14刘伟平，杨新春，殷明刚.八项主要血细胞分析指标的测量不确定度评估及分析网.医学检验与临床，2018,29(6)：25-27.5毛瑞，曹三成等.临床实验室干式生化检测项目测量不确定度的评估与分析.现代检验医学杂志，2019,34(5)：153-159.6中华人民共和国卫生部.WSZT403-2012临床生物化学常规项目分析质量指标S.北京：中国标准出版社，2013.17王前明，宋秀宇，洪强.“自上而下”方法在评定生化检测指标测量不确定度中的应用JL国际检验医学杂志，2014,35(9)：1169-1171.8欧明才,江剑辉等.新生儿遗传代谢病筛查随访专家共识目.中华医学遗传学杂志,2020,37(4):367-371.9尚世强，杨建滨.新生儿疾病筛查和诊断发展及存在的问题思考叫.中华检验医学杂志，2015,38(4)：217-219.HOJ中华医学会儿科学分内分泌遗传代谢组，中华预防医学会出生缺陷预防与控制专业委员会新生儿筛查学组.高苯丙氨酸血症的诊治共识J.中华儿科杂志，2014,52(6):420-425.