生物制药工艺学第10章离心技术.ppt
第九章 离心技术,本章要求：基本概念：离心力，相对离心力，沉降速度，沉降系数。掌握：相对离心力的计算螺旋卸料离心机的特点影响沉降速度的因素制备型离心机常用的转子差分离心法速度区带离心法及其特点，等密度离心法及其特点.密度梯度离心常用的介质有哪几类：密度梯度的制备方法梯度的回收方法了解：分析型离心技术：,第一节 基本原理和设备,一、沉降和离心 沉降作用：悬浮液静置时，在重力作用下，密度大于周围溶液的固体颗粒逐渐下沉。漂浮作用：影响沉降的因素：颗粒大小、颗粒密度、溶液黏度 离心技术:利用旋转产生的离心力代替重力，加速固体沉降速度的一种分离方式。,离心技术有多种形式：1离心沉降2离心过滤3离心分离4离心分析,二 离心力,1 离心力（centrifugal force，Fc）：在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到的向外的力。离心力（Fc）的大小等于离心加速度2r与颗粒质量m的乘积，即：F=m2r,相对离心力（relative centrifugal force，RCF）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，在相同转速下离心力会变化，RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。式中r为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；N为转子每分钟的转数（rpm）。,三 沉降速度 即在离心力作用下，物质粒子于单位时间内沿离心力方向移动的距离。,四沉降系数 在单位离心力场中，颗粒的沉降速度谓之“沉降系数”,五 沉降时间 六 转子常数 七 分子量计算,八、离心机,（一）离心机的分类1按转速高低及是否有冷冻来分（1）普通离心机，小于6000rpm（2）高速离心机，8000-25000rpm（3）超速离心机，25000-80000rpm2按结构分类（1）台式离心机（2）立式离心机（3）沉降式离心机（4）转头式离心机（5）电动式离心机,3按工作性质分类（1）制备型离心机（2）实验室用离心机，4按操作方式分类（1）连续离心机。（2）人工卸料（出渣）离心机；（3）自动卸料离心机（如螺旋式离心机）,（二）常用离心机1 普通离心机2管式高速离心机原理：应用：液固，液液，发酵工程酶工程中分离菌体,3 蝶片式离心机,4 离心过滤机,5 卧式螺旋卸料沉降离心机,6 冷冻高速、超速离心机,第二节 制备型超离心技术,一、离心设备（一）转子1 角度转子2 水平转子3 区带转子4 垂直管转子5 连续离心转子 6 细胞洗脱转子,（二）离心管 由管体和盖组件两部分组成,二、离心方法 差分离心（离心沉降）、密度离心法（离心分离）（一）差分离心概念：差分离心法亦称为“差速离心法”，是依据不同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不同进行离心分离的一项技术。过程是将样品溶液在一定离心力场中离心一定时间使颗粒大组分沉降于管底，上层液再用加大的离心力场离心一定时间，又可获得中等大小的组分。如此依次提高离心力，逐级分离出所需组分，故称其为差分离心法。,用途：差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于颗粒或密度差别较大的组分的分离，或其他分离手段之前的粗制品提取。,（二）速度区带离心法概念：又称速率区带离心法或分级区带离心法。离心操作时将样品液置于连续或不连续，线性或非线性密度梯度液上（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），控制离心时间，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，从而达到彼此分离的目的。这种离心方法称速度区带离心法。,特点：（1）样品加于梯度介质的顶部、离心时间须严格控制。（2）介质的密度亦须严格掌握：梯度最大值组分最小密度。（3）样品的密度梯度密度最小值。（4）分离依据是各组分之沉降系数差。（5）分辨率受组分沉降系数，离心时间，颗粒扩散系数，介质粘度及梯度范围和形状的影响。用途：本法适于分离颗粒大小不同而密度相近或相同的组分，如DNA与RNA混合物、核蛋白体亚单位及线粒体、溶酶体及过氧化物酶体等。,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞,(一)原理:红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单核细胞。(二)方法:1.在短管中加入适量细胞分离液。2.取肝素抗凝静脉血，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。离心2000rpm20分钟。3.离心后管内分为三层，上层为血浆，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入倍以上体积的Hanks液或RPMI1640，1500rpm10分钟，洗涤细胞两次。,（三）等密度离心法概念：离心力作用下，不同密度的多组分颗粒在梯度介质中“向上”或“向下”移动，当移动至其密度与介质密度相等的位置便不再移动，形成静止区带，即达到离心平衡，各组分按密度不同处于区带的不同位置。该离心方法称等密度离心法。,特点：（1）加样位置不拘。（2）离心平衡后，区带的位置、形状、不受离心时间影响。（3）梯度的密度范围应包括样品中所有组分颗粒之密度。（4）分离依据是颗粒组分间密度的差异，与颗粒大小，形状无关。（5）离心力大小，组分颗粒的大小和形状，介质密度梯度的斜率和形状，粘度影响离心时间和分辨率。,Percoll 非连续等密度梯度离心法纯化牛肾上腺嗜铬细胞疼痛和帕金森病，体外无增殖能力，只能依赖于肾上腺髓质的分离来获取。实验动物年龄在1 岁左右的健康小公牛，体重约200 400 kg,取小公牛肾上腺，D-Hanks 溶液冲洗后，肾上腺充分消化后剥除皮质，将髓质剪碎成1 mm左右的小块，滴加少量DHanks液以保持髓质的营养，将滤过的细胞悬液在100 g 下离心8min，,将细胞悬液离心后与密度为1.090 g/ml 的Percoll 溶液混合，加入离心管底部，在其上分别缓慢加入密度为1.064 g/ml、1.034 g/ml、1.019 g/ml 的Percoll 溶液，室温下离心，200 g，20min。收集介于密度为1.064 g/ml 与1.034 g/ml 的两层Percoll溶液界面之间的细胞，加入D-Hanks 液混悬后，在100 g 下离心洗涤2 次，每次8 min。得细胞。,五、密度梯度技术,（一）密度梯度的作用:1.增加分离层次，提高分辨率。2.防止温差及振动造成的影响。（二）对密度梯度的基本要求 1 梯度介质应自身密度大，且溶解度足够大，以便制作出密度范围大的密度梯度。2 理化性质稳定，生物惰性；离子强度低，渗透压小，粘度小。3 具某种可测性（如折射率）以测其浓度（密度），但不干扰分离组分的测定。4 便于除去或回收。此外还有纯度，价格等因素。,(三)密度梯度的设计1梯度介质的选用:(1)盐梯度介质(2)小分子有机物如蔗糖(3)三碘化苯衍生物(4)有机高聚物(5)胶态二氧化硅,六:常见的密度梯度材料及应用 蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。,卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离其高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。,2梯度的密度范围3梯度的形状4梯度的容量5线性梯度的斜率(结合离子交换的条件研究),（二）梯度的制备1 手工制备法 2 梯度混合仪制备法3 离心形成法4 反复冻融法,离心操作,（一）加样和离心 样品准备:加样:离心:,（二）梯度的取出与收集取代法、穿刺法、切割法、虹吸法。,C:梯度分析:测定梯度浓度意义梯度测定法样品测定E:离心制备的步骤:组织-匀浆-过滤-分级离心-梯度离心F:制备超离心注意事项:注意平衡查阅目的物信息,第三节 分析型超速离心法与制备用机型的不同点：1由于盛液器（离心池）有“光学窗口”，故受材料强度限制，允许转速略低，在80000以内使用。2转速与温度直接影响测定数据，必须控制很严：转速偏差1.5，温差0.1 3附有动态光学检测，数据分析系统。,分析超离心的方法 分为沉降速度法和沉降平衡法.沉降速度法据颗粒在离心场中移动速度来测定其沉降系数、分子量或纯度等的方法称沉降速度法.,沉降平衡法 用沉降平衡过程测定生物大分子的沉降系数或分子量的方法称沉降平衡法。特点：低转速下的离心分析法，时间长（数小时至数日）,超速分析离心的应用,1 对生物大分子均一性估计2 生物分子形状、大小、水合程度的估计3 生物分子构象变化的检测,
