白酒酿造工演讲.ppt

微生物与白酒酿造,叶光斌酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,报告提纲,白酒香型与评酒会白酒微生物研究现状（重点）白酒微生物的研究方向白酒微生物研究存在的问题酿酒生物技术以应用-四川省重点实验室,酱香,浓香,清香,米香,豉香,芝麻香,凤香,药香,老白干,兼香,特香/馥郁香,山东景芝白干,贵州茅台,单粮：四川泸州老窖,山西汾酒,河北衡水老白干,陕西西凤酒,湖南酒鬼酒,江西四特酒,贵州董酒,广西三花酒,广东玉冰烧,酱兼浓：湖北白云边浓兼酱：黑龙江玉泉酒,半固态发酵,固液发酵,白酒的香型分类,多粮：五粮液,评酒会与白酒香型,白酒香型分流，直接得益于全国评酒会。我国曾经举办过五次评酒会，简单回顾如下：1952年，中国专卖总公司在北京组织了第一届全国评酒会，评出了茅台酒、汾酒、泸州大曲酒、西凤酒等四大名酒。当时国家处于经济恢复时期，报送的白酒酒样只有19种，评比的标准也相对单一。1963年10月，轻工部在北京组织了第二届全国评酒会，评出了五粮液酒、古井贡酒、泸州老窖特曲、全兴大曲酒、茅台酒、西凤酒、汾酒、董酒等我们今天所谓的“老八大名酒”，同时还评出了“双沟”等9种优质白酒。首次采用“按酒的色、香、味百分制打分”的评定方法。1979年8月，轻工部在大连组织了第三届全国评酒会，评出了茅台酒、汾酒、五粮液酒、剑南春酒、古井贡酒、洋河大曲酒、董酒、泸州老窖特曲酒等八大名酒和西凤酒等18种优质白酒。本次评酒会首次确立了按照香型和糖化剂进行分类评比，将白酒香型分为酱香、浓香、清香、米香、其它香等五类，并对五类香型白酒的感官指标描述进行了初步界定，同时参考了轻工部关于高度酒向低度酒转化的基本方针。,1984年5月，中国食品工业协会在太原组织了第四届评酒会，第四届全国评酒会由于参加评比的酒较多，分三次举行：第一次是1983年6月召开的，评选葡萄酒和黄酒；第二次是1984年5月召开的，评选白酒；第三次是1985年5月召开的，评选啤酒、果酒和配制酒。白酒增加了药香型、凤香型、豉香型等三个新香型，评出了飞天牌茅台酒、古井亭牌汾酒、长城牌汾酒、五粮液牌五粮液等13种国家名酒（金质奖）和武陵牌武陵酒等27种国家优质酒。1989年1月，中国食品工业协会在合肥组织了第五届评酒会，又增加了兼香型、芝麻香型、特型等三种香型，评出了“飞天”、贵州牌茅台酒，“古井亭”、“汾字”、长城牌汾酒等17种国家名酒（金质奖）和龙滨牌特酿龙滨酒等53种国家优质酒（银质奖）。,经过五届全国评酒会，白酒共确立酱香型、浓香型、清香型、米香型等四大香型和药香型、凤香型、豉香型、兼香型、芝麻香型、特型等六小香型。第五届评酒会之后，“国家名酒”评定工作被叫停，但白酒香型分流却成为一股不可抗拒的历史潮流，继续影响着白酒行业发展的格局。,反思：香型分流，路归何方？,五届评酒会之后，企业纷纷开始自有香型的认定，比如说“酒鬼酒”确立了馥郁香型，“衡水老白干”确立了老白干香型等，白酒的香型特色体系越来越丰富。在确立香型的过程中，企业的科研水平得到了提升，产品质量得到了稳定和提高，这些对于白酒行业的未来发展都是非常有利的。但即便如此，业界还是有反对声音：反对者：白酒分香型，是评酒会的产物，也只是为专业的评酒工作提供借鉴，对于消费者没有什么意义。而且白酒香型越分越细，白酒体系变得越来越复杂，这未必是一件好事。反对者：中国白酒的消费群体，以30岁以上年龄段的低消费人群为主，他们是否习惯于认知庞杂的白酒香型体系？年轻一代的消费者的消费心理状况如何？是否也能接受体系庞杂的中国白酒？如果连我们自己都认识不清我们的白酒体系，又怎么能让国际友人接受我们的白酒？白酒在中国酒市场中占据主导地位，消费者对于白酒香型的认识越来越丰富。比如说有人认为白酒中的香味成分“清”不如“浓”，“浓”不如“酱”，因此清香型酒的价格理应低一点。也有人认为，香味成分是酒后上头的罪魁祸首，论健康饮酒，还是“酱”不如“浓”，“浓”不如“清”。白酒受地理特征、地域消费习惯，以及原料、酿造工艺、贮藏条件、勾兑方法等方面的影响，区域特征明显，很难用某种香型来概括整个白酒的酒体风味。消费者已经开始根据白酒香型来选择自己消费需求。需要我们能够加以科学引导，让这世界上最庞大的蒸馏酒消费群体能够正确认识白酒的香型特色体系。,什么是大曲白酒？,大曲白酒:以大曲为糖化发酵剂生产的白酒;以大麦、小麦、豌豆等为原料制曲，块型大，故称大曲;大曲以自然接种、自然发酵、网罗多种微生物，包括原料、空气、场地等;大曲中香味成分多，有多种微生物发酵而成;同条件下，大曲白酒质量好，但成分复杂;,白酒的定义是:以曲类、酒母为糖化发酵剂，利用淀粉质(糖质)原料，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、陈酿和勾兑而酿制而成的各类白酒。,什么是白酒微生物？,大曲：自然接种+人工控制,窖泥：长期发酵过程中形成特异的、驯化的微生态系统.,酿酒过程的自然环境因素：如气候、地理位置、曲房、窖池周边的空气、工具、人员相关的环境微生物.,白酒微生物研究现状,大曲微生物,窖泥微生物,空气微生物,糟醅微生物,洞藏微生物,比较：低、中、中高温、高温大曲微生物差异,方法：传统方法,比较：不同香型窖泥微生物差异,比较：不同香型、发酵时间微生物差异,1 研究对象及内容,大曲微生物的研究,1995年，唐玉明等人以泸州老窖酒大曲为主要研究对象，分析了制曲过程中曲皮和曲心微生物种群与生化性能的变化，对贮存3个月后的成品大曲曲皮与曲心的微生物数量及生化性能亦作了分析测定；并分别以曲皮、曲心在同等条件下进行了酿酒效果试验。结果表明，微生物数量在人房初期出现高峰，到中期显著降低，后期曲外层略有低落而曲心略有升高；培曲过程中曲外层的酶活力显著高于曲心，贮存后曲心的酶活力虽有提高，但仍明显低于曲外层；曲外层的微生物数量及酶活力虽显著高于曲心，但酿造效果却表现为曲心的出洒牢及酒中的醋酸含量明显优于曲外层，酒的总酸含量相反。,姚万春等对贮存期分别为3、6、9、12个月的泸型大曲中微生物种群、酶活性及酿造效果进行测定，结果表明，陈曲中微生物群体随贮存期的延长而减少，6个月以上的大曲酵母大量减少酶活力降低，超过9个月淀粉含量明显减少。酒中总酸、总酯含量随贮存期延长而降低。并建议泸型曲最好贮存期为36个月。,唐玉明等对大曲发酵房上中下层空气微生物及曲药质量差异研究，提出曲药培菌期间，环境微生物对曲药质量的影响可能主要受酵母菌和细菌的影响。,2001年，唐玉明对浓香型曲药细菌的分类鉴定进行了初步研究，结果表明浓香型大曲中含有大量的微生物，主要来源于原料、水、环境(空气、场地)微生物，以霉菌、酵母为主，但细菌还是不少，尤其是高温曲细菌种类更多，细菌以芽孢杆菌为主。,2005年，姚万春等人系统地研究了泸州老窖国窖曲不同层次问微生物数量、种类和优势种群的差异及规律。结果表明，国窖曲层次间微生物数量、种类和优势种群差异较大。,2000年，唐玉明等收集国家名优酒厂不同季节、不同贮存期的感官的上等曲样200多个。通过增殖培养，分离纯化，获得原始菌株219株。其中霉菌69株(包括酯化菌4株)，酵母菌25株，细菌125株。,酒醅中微生物的研究,郭霞从酒糟中分离出酵母菌8株、细菌3株和霉菌4株，并分别选取10株和15株进行混菌发酵试验，认为在浓香型白酒发酵过程中，菌株在15株以上为宜。,窖泥中微生物的研究,20世纪80年代以来，中科院成都生物所吴衍庸对泸州老窖进行了深入的研究，发现并分离利用甲醇的生丝微菌，可降低白酒中甲醇含量，还可利用其去除再利用水中的硝酸盐。从浓香型酒老窖中分离出一株产甲烷杆菌，开发出甲烷细菌与己酸菌共酵的二元发酵技术。从泸州老窖泥中分离出产己酸的细菌，为推广人工老窖发酵浓香型酒作出了重要贡献。,吴飞对沪州窖池与全兴窖池中酵母菌的变化情况作了研究，结果表明，发酵工艺对微生物消长情况有较大的影响。从优势菌群来看，每个窖池都有个属的酵母优势菌群，但是各个窖池中分布的优势菌又有所差异。,张文学采用传统微生物分类鉴定法，对泸州老窖不同窖龄窖池窖底和窖壁泥样中的可培养兼性厌氧细菌进行了分类计数，并初步鉴定到属。其大部分属于芽孢杆菌属(Bacillus)和芽孢乳杆菌属(orolactobacillus)，也存在假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)等。,王茂等从窖泥中分离筛选得到3株不同的乳酸菌，鉴定为玉米乳杆菌(Lzeae)、戊糖乳杆菌(LPentosus)、乳酸片球菌(Pacidilactici)。,刘莉萌等人对3个不同的浓香型白酒酒醅发酵窖池的片球菌进行研究，共分离得24株菌株。经生理生化鉴定和16SrRNA基因同源性分析，结果表明，其中20株菌属于片球菌属的7个已知菌种，并提出了2个新种：酒窖片球菌和耐乙醇片球菌。,大曲、糟醅和窖泥中报道的可培养微生物类群：大曲：霉菌、酵母、细菌（芽孢杆菌）糟醅：霉菌、酵母、细菌窖泥：芽孢杆菌、乳酸菌、己酸菌、丁酸菌、醋酸菌、甲烷菌、放线菌,传统培养法分离微生物,0h,6.5h,34.5h,43.5h,个人研究样品,1 不同堆积时间郎酒糟醅样品,2 不同香型窖泥样品：郎酒和泸州老窖窖泥,3 不同香型大曲样品：郎酒、泸州老窖和汾酒大曲,微生物的显微结构,传统方法微生物计数,郎酒窖泥、大曲、堆积糟醅微生物计数结果,传统研究方法存在的问题1 传统培养只能针对常见的可培养微生物进行研究，难以针对整个白酒微生物群落体系进行系统研究？2 传统培养计数受人为因素影响较大，如培养基因素、微生物污染等。3 传统方法对于微生物种群无法鉴定到种，仅仅较为简单的对微生物大类进行研究。,2.1 传统微生物培养、计数、鉴定、应用,微生物菌落计数：稀释涂平板法/稀释倒平板计数,2 研究方法,、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在4050左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。、涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。,2.2 新的培养方法的引进及新的培养基的设计,厌氧培养技术,、富集培养法富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。,其他培养方法,提高微生物可培养性的方式可分为两大类，即改进培养措施和开发新型培养技术。改进培养措施主要采用减少毒性氧物质的毒害作用、维持微生物间的相互作用、供应新型的电子供体和受体、分散微生物细胞、延长培养时间、利用琼脂替代物等方法。新型培养技术主要包括稀释培养法和高通量培养法、扩散盒培养法、细胞包囊法、序列引导分离技术等。,新的微生物培养技术,2.3 分子生物学技术在现代白酒微生物研究的应用,原理分子生物学技术在白酒微生物研究的应用研究方法,16S rRNA基因与系统发育树,张文学等利用免培养法提取浓香型白酒曲药中细菌的总DNA在分子水平上运用PCR扩增技术和16S rDNA序列同源性分析等方法测定曲药中细菌的16S rDNA基因近全序列，并建立系统发育树图。结果表明，组成该曲药中的细菌分属于Delftia、Dysgonomonas、Bacteroidetes、Proteobacterium、Nocardiopsi、Pseudomonas和A rthrobacter几大类群，表现出高度的细菌多样性用。,分子生物学技术在白酒微生物研究的应用,张文学等还利用18S rDNA片断克隆分析和同源性比较，研究发现，浓香型白酒窖池中心糟醅中存在Torulaspora、Talaromyces、Issatchenkia、Saccharomycopsis、Trichosporon、Eurotium、Aspergillus、Zygosaccharomyces、Fomitopsis等9个真菌分类属，最主要类群是Issatchenkia、Talaromyces、Aspergillus和Eurotium等4属，并阐述了各菌属在发酵前中后期的变化情况。同时他们还发现好氧性霉菌在发酵中后期的较大量存在和一定程度 升，提出发酵中后期窖池厌氧程度并非在逐渐增加和好氧性堪 细胞内存在氧化磷酸化耦合机制，以提供霉菌所需要的分子氧两种假设。,王海燕等对白酒窖池发酵的全程跟踪取样，借助于PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)和16S rRNA基因文库两种方法，对比研究了江苏地区浓香型和芝麻香型白酒酒醅在发酵过程中的微生物菌群结构。DGGE图谱分析显示，随着发酵时间的延长，酒醅中的微生物多样性不断降低；发酵结束时Lactobacillus manihotivorans成为最主要的优势菌种。16S rRNA克隆文库的测序结果在数据库中进行比对后表明，浓香型和芝麻香型酒醅中的微生物种属存在巨大差异，仅有Weissella、Bacillus、Acetobacter和Lactobacillus 4个属的微生物在两个文库中均能检测到，发现并鉴定出在白酒曲药和酒醅的研究中尚未报道的细菌属。,2.3.1 基于PCR的群落分析技术：ARDRA,ARDRA(核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析,Amplifed Ribosomal DNA Restriction Analysis),通过对不同带型的克隆子的测序和不同类群克隆子数量的统计分析，确定环境中各微生物种群的相对丰度和群落组成。,细菌16S rRNA基因文库克隆子MspI酶切图谱,优点：快速，可较为详尽的获得所研样品的微生物群落结构信息。,缺点：适合于研究较少的样品，且步骤较繁琐。,2.3.2 基于PCR的指纹技术：DGGE,优点：快速，可同时分析多个样品间微生物群落差异,缺点：存在一定技术上的问题，只能获得主要微生物类群的信息，重复性较差,2.3.3 基于PCR的指纹技术：T-RFLP,优点：快速，可同时分析多个样品间微生物群落差异,缺点：对于每个峰对应的微生物类群的确定存在一定技术上的问题，重复性较差,微生物生态学研究方法的优缺点,优点通过研究微生物种群和个体的核酸、蛋白、代谢等信息，构建微生物系统发育树和分子数据库。可以发现未知类群，并了解其相关信息。缺点无法获得微生物全部信息，需要获得微生物纯培养或获得微生物单体的情况下，才能作全面分析。,相关分子生物学网站核酸数据库：美国国立生物技术信息中心/欧洲分子生物学实验室http:/日本DNA数据库 核糖体数据库 嵌合体检测：系统发育树建树数据库：/蛋白质数据库：http:/http:/,2.4 其他相关技术的应用,2.4.1 显微荧光染色技术2.4.2 基于PCR的微生物定量技术2.4.3 宏基因组文库技术2.4.4 基因芯片技术2.4.5 新的测序技术：454测序技术,DAPI、FISH计数技术,Amann等通过FISH 技术，确定SRB与ANME耦合的相关类群,2.4.1 显微荧光染色技术,Q-PCR、QC-PCR计数技术,Q-PCR流程,2.4.2 基于PCR的微生物定量技术,Q-PCR：荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,QC-PCR又称竞争性PCR，是指同一PCR反应中，待扩增目的DNA(即环境样品DNA)和不同梯度的内标DNA竞争性扩增，目的DNA的含量通过竞争性内标DNA的含量决定。该方法只能作半定量，不及Q-PCR精确。,标准品精确度和灵敏性,样品对应基因含量的检测,宏基因组学(metagenome)是分子生物学技术应用于微生物生态学研究领域而形成的一个新概念和重要的生物资源。,2.4.3 宏基因组文库技术,2.4.4 环境基因组芯片,周纪中等通过功能基因芯片研究环境样品的代谢特点,可以利用核糖体小亚基基因芯片，扫描环境样品，确定环境中微生物组成及丰度。,存在的问题：核糖体小亚基基因芯片的制备：微生物序列信息的收集，序列信息的特征化，信号识别？,454 GS FLX 基因组测序仪,2.4.5 新的高通量测序技术,GS FLX 基因测序仪是一种新的依赖生物发光进行 DNA 序列分析的技术，在 DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个 dNTP 聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定 DNA 序列的目的。,454 GS FLX 基因组测序仪是目前国际上最先进的基因组测序仪，具有超强测序能力，日产出 200Mb，可读 250 碱基/反应，因此可建立高通量基因组测序平台；高性能并行计算机和服务器及配套软件，建立信息处理平台与数据库，大大提高生物信息学分析能力；拥有超强的功能验证和解析能力。,参考的实验技术流程,样品,化学参数分析,DNA提取与纯化,QC-PCR定量,引物设计,DGGE、克隆文库构建,数据库比对，系统进化树构建,微生物的分离培养,整合所有数据，分析微生物群落结构及生态学功能,宏基因文库的构建和筛选,白酒微生物生物资源的开发与利用：能源，药物，酶制剂等,白酒微生物的研究方向,白酒功能微生物的分离及应用白酒主要微生物生态学的的研究白酒微生物的酶类研究微生物与主要呈香呈味物质相互关系的研究白酒微生物的固定化技术制曲的标准化和窖泥老熟技术,大曲制备的标准化、人工窖泥制备的标准化与白酒工业实际：多香型多风格之间的矛盾白酒功能微生物的开发、应用研究的滞后，以及与白酒工业实际：多香型多风格之间的矛盾,白酒微生物研究存在的问题,酿酒生物技术以应用四川省重点实验室,现有固定研究人员56人，其中教授9人，副教授15人，高级工程师12人，博士6人，硕士18人，中国酿酒大师2人，国家级白酒评委5人，省级白酒评委19人。,酿酒生物技术及应用四川省重点验室是由四川理工学院、泸州老窖股份有限公司和四川省食品发酵工业研究设计院联合共建，面向国内外开放的重点实验室，是我国唯一以传统白酒研究为特色的省级重点实验室。,微生物培养设备,显微照相系统,Biolog微生物鉴定系统,荧光定量PCR仪,核酸检测仪,琼脂糖检测系统,D-Code突变检测系统,PCR基因扩增仪,pH计,台式冷冻离心机,凝胶检测系统,气质联用色谱,实验室良好的学术氛围和师资力量，为白酒微生物及相关研究提供良好的科研平台。实验室与各名优白酒企业及食品企业间建立了产学研合作的良好模式，保证了科研的顺利开展。,相关拓展阅读白酒生产方面：沈怡方.白酒生产技术全书，中国轻工业出版社，1998周恒刚，徐占成.白酒生产指南，2000李大和.白酒酿造工上、中、下，中国轻工业出版社，2006肖冬光，白酒生产技术，化学工业出版社，2005余乾伟、曾祖训.传统白酒酿造技术，中国轻工业出版社，2010李大和.低度白酒生产技术(第2版)，中国轻工业出版社，2010沈毅文.简明白酒实用技术，中国轻工业出版社，2009马荣山、张广新.白酒酿造及新型白酒工艺学，沈阳出版社，2005谭忠辉、尹昌树.新型白酒生产技术，四川科学技术，2007陆寿鹏、张安宁.白酒生产技术，科学出版社，2008广州纯粮生料酿造技术有限公司.生料优质白酒实用生产技术，华南理工大学出版社，2004黄平,张吉焕.凤型白酒生产技术，中国轻工业出版社，2003康明官.清香型白酒生产技术，化学工业出版社，2005王元太.清香型白酒酿造技术，中国轻工业出版社，2009,白酒尝评勾兑及理化分析方面：周恒刚，徐占成.白酒品评与勾兑，中国轻工业出版社，2004 赖高淮 新型白酒勾调技术与生产工艺，中国轻工业出版社，2003王瑞明，白酒勾兑技术，化学工业出版社，2007吴广黔，白酒的品评，中国轻工业出版社，2008李大和.白酒勾兑技术问答，中国轻工业出版社，2006赖高淮.白酒理化分析检测，中国轻工业出版社，2009王福荣.酿酒分析与检测，化学工业出版社，2005相关论文：张文学等.中国浓香型白酒窖池微生态研究进展.酿酒，2004，31（2）：31-35.王旭亮等.白酒微生物研究与应用现状.酿酒科技，2009，6（总180）：88-91.张惠文等.分子微生物生态学及其研究进展.应用生态学报，2003，12（2）：286-292.张秀明等.海洋微生物培养新技术的研究进展.海洋科学，2009，33（6）：99-105.孙广宇等.核苷酸序列分析在真菌系统学研究中的应用.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2003，31（6）：187-192.,Thank you for your attention!,