生物选修3基因工程操作程序.ppt

1.2 基因工程的基本操作程序,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,补：真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增(PCR仪),（3）人工合成（DNA合成仪）,目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库,基因组文库与部分基因文库的关系,2.基因组 文库的构建,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,与载体连接,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基因,分离,反转录法,mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,3.cDNA 文库的构建,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？,1）DNA自动测序仪：2）PCR技术：,对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,PCR技术扩增目的基因,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_(做启动子)、_.前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(二)利用PCR技术扩增目的基因,过程：,a、DNA变性（95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（72）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,(三)直接人工合成,通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成,DNA合成仪,根据已知的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料直接合成目的基因。,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成,一、目的基因的获取,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,4.过程:,5.基因表达载体的组成：,复制原点、目的基因、启动子、终止子、标记基因,它们各有什么作用?,基因表达载体的构建,1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。2）用限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,转化,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,三、将目的基因导入受体细胞,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍（2）原理及适用范围,2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：,3、将目的基因导入微生物细胞（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？（2）方法：,受体细胞为受精卵,Ca2+感受态细胞,1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,将目的基因导入微生物,受体细胞中真正摄入了含目的基因的重组质粒很少，必须将它从中检测出来。利用标记基因（抗生素抗性基因）进行筛选。过程如下：,1.选择不含标记基因的大肠杆菌，并用Ca2+处理受体细胞。2.将“重组质粒”与上述大肠杆菌在缓冲液中混合培养。3.将每个受体细胞单独培养在含抗生素的培养基上，有菌落出现则说明导入“重组质粒”成功。,重组质粒的导入是否成功呢？,进一步检测菌落中是否有目的基因的”表达产物”。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫或抗病鉴定、功能活性鉴定,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,从人体中克隆出胰岛素基因的编码序列(cDNA);将cDNA前接上在大肠杆菌质粒中，构建成一个表达载体（含四环素抗性基因）;将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌.若表达载体未进入大肠杆菌,会因无抗四环素基因而死亡;若培养基上长出大肠杆菌,说明胰岛素基因已进入了大肠杆菌中;培养含有胰岛素基因的大肠杆菌,收集菌体,破碎后从中提取人的胰岛素.,试叙述大肠杆菌如何产生人的胰岛素过程？,1.目的基因的获取从基因文库中获取(建库的方法：直接分离法、反转录法、根据已知氨基酸合成DNA法)利用PCR技术扩增化学方法人工合成2.构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法（植物）、显微注射技术（动物）、微生物4.目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：抗性鉴定、功能活性鉴定,本节总结,1）以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,典型例题,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制（）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,4）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,