生物第一节DNA重组技术的基本工具.ppt
1.1 DNA重组技术的基本工具,基因工程的概念,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,抗虫害的玉米,转基因鲑鱼,基因工程产品,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),基础理论和技术的发展催生了基因工程,DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译基因转移载体的发现工具酶的发明DNA合成和测序技术的发明DNA体外重组的实现重组DNA表达实验的成功第一例转基因动物问世PCR技术的发明,DNA重组技术的基本工具,限制性核酸内切酶准确切割DNA的工具，即“分子手术刀”DNA连接酶DNA片段的连接工具 即“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体基因转移工具 即“分子运输车”,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,分 布：主要从原核生物中分离纯化得到作用特点：特异性，即识别双链DNA分子的 特定核苷酸序列，切割特定切点切 点：每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键种 类：约4000种举 例：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开,结 果：,形成两种末端,黏性末端,平末端,限制酶所识别的序列有什么特点,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。,限制性内切酶,限制酶,1.什么叫黏性末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。,2.什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,3.限制酶在原核生物中的作用,原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。,二、DNA连接酶“分子缝合针”,1.连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为Ecoli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。2.这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。3.Ecoli连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。,DNA连接酶“分子缝合针”,DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？,答：不是一回事。（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成）（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端 的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸 二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,三、基因的载体“分子运输车”,2.载体必须具备的条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选；（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）对受体细胞无害。,1.载体的作用：将外源基因转移到受体细胞中去。利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。,3.常用的载体有：质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等,质粒,质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。,要对天然质粒进行人工改造,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。,练习,1.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶 B.两种限制酶同种连接酶 D.两种连接酶,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制（）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,3.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端。,T,磷酸二酯键,A,
