生物样本分析.ppt

生物样本分析岛津自动前处理系统（Co-Sense for BA LCMS）,药代动力学研究的内容,药代动力学应用动力学原理研究药物吸收、分布、代谢和排泄过程。药物剂量与药理效应的相互关系研究 人体生理及病理状态对药物体内过程的影响 药物制剂的生物利用度测定 药物相互作用评价生物样品包括各种体液和组织,血浆中微量药物或代谢产物的测定,药物化学结构的特点,世界药物索引1999收载药物总数：51596可离子化药物：62.9%，其中 酸性化合物14.5%碱性化合物67.5%两性化合物18.0%分子量一般 500 离子化 质谱分析,血浆样品的特点,基质复杂 选择性强待测物含量低 灵敏度高浓度差异大 线性范围宽,生物样品中的药物分析前处理的要点除蛋白质，分离纯化浓缩液液萃取法 固相萃取法 规模缩小的柱色谱法直接沉淀法 超滤法,血浆样品加入提取溶媒（酸化或碱化）涡旋离心取上清液吹氮气浓缩残渣溶解过滤进样色谱分析,样本前处理一般步骤,药代动力学研究面临的挑战,高效液相色谱法（HPLC）的特点和局限：灵敏度：定量限一般为 10100 ng/ml，选择性差测试速度：每个样品 1520 min，低通量对结构分析提供的信息很少需求：灵敏度：ng/ml 浓度，高选择性制剂生物等效性实验：5001000 样品新药研究：分析超过 10000 个生物样品,液相色谱-质谱联用法的发展,1977年，LC/MS开始投放市场1978年，LC/MS首次用于生物样品分析1991年，API LC/MS用于药物开发,数据来源：American Society for Mass Spectrometry,2002,药物色谱分析中不同方法的比例,1990年,2000年,LC/MS 法测定人血浆中克拉霉素的浓度,克拉霉素(clarithromycin)红霉素衍生物新一代对酸稳定的口服大环内酯类抗生素,以往克拉霉素血药浓度测定多采用微生物法HPLC紫外检测,克拉霉素,检测条件 流动相:0.05%冰醋酸和乙腈（4060 v/v）流速:0.2mL/min 色谱柱:Shim-pack ODS 150mm2.0 mm I.D.5m 柱温:40 质谱离子化方式：电喷雾离子化（ESI）离子极性:Positive；选择性离子检测(SIM):克拉霉素m/z:748.5M+H+罗红霉素m/z:837.5 M+H+内标物 14-羟基克拉霉素m/z:764.5M+H+,血浆样品的处理 血浆样品,内标罗红霉素,碳酸钠溶液碱化后乙醚提取,上清液用氮气吹干。最后残渣乙腈溶解。方法的专属性克拉霉素、内标、14-羟基克拉霉素的保留时间分别为1.93min、1.93min、1.92min,岛津自动前处理系统（Co-Sense for BA LCMS）,内容,自动前处理的优点与问题 自动前处理系统Co-Sense for BA的特长 采用新型色谱柱和稀释系统实现了高回收率使用新型色谱柱的自动浓缩系统实现了高灵敏度 Co-Sense for BA+LCMS系统的特长,背景,样品前处理是目前分析化学的瓶颈，是分析化学研究的难点和热点问题之一。由于样品数量极多，且分析物含量越来越低、基体越来越复杂，迫切要求发展高通量、高选择性、高效率的在线样品前处理技术。因此，开展这方面的研究具有极为重要的意义。,HPLC/LC-MS广泛应用于血浆或血清的代谢物分析和原药分析，一般的血浆和血清分析，需要对样本进行预处理，以除去蛋白质，这样会降低精确度和工作效率。引入了具有限制性通路媒介（restricted access media-RAM）的预柱，可对血浆样本进行直接分析，而不必进行预处理。这样，可提高精确度、简化操作和提高工作效率。但是，使用限制性通路媒介柱，也存在一些问题，需解决的问题：回收率、灵敏度、耐用性。,生物样品中的药物分析前处理的要点除蛋白质浓缩手工前处理的问题处理时间重现性药物回收率,前处理的现状,除蛋白、浓缩操作自动化的优点提高分析精度脱线处理时，难以保持操作完全一致，有时分析精度变差。提高操作简便性脱线处理时需操作熟练提高处理效率夜间可自动运行，大幅度地提高了处理效率前处理自动化的课题提高回收率及提高浓缩率,自动前处理的优点和课题,提高回收率的手段,有必要使与蛋白质结合的药物游离出来与蛋白质结合的药物，在除蛋白质处理时，药物也与蛋白质一起被除去，药物回收率降低。切断蛋白质结合（离子结合，疏水结合）调整样品导入溶液的pH值碱性药物时，使用pH值低的溶液酸性药物时，使用pH值高的溶液调整样品导入溶液的离子强度20-100mM的缓冲液浓度在样品导入溶液中添加有机溶剂在20%以内使用有机溶剂（防止由蛋白质的变性而产生的析出）使用界面活性剂(*)从药物保持（使用反相柱）的方式看，有抑制药离子化的pH 值较为理想。,方法,我们研究开发出优质的限制性通路媒介（RAM）预柱，应用柱切换HPLC系统及其在线稀释旁路系统，可对血浆直接进行药物分析。我们的系统.,回收率 即使是紧密与蛋白质结合的化合物，也能被预柱吸附（捕集），并且回收率几乎达到100%灵敏度 目标化合物可进行浓缩和分离即使是大体积进样分析也如此。不会造成峰值恶化。耐用性 新设计的涂渍技术和粒径优化技术，使得数据保持稳定，即使是 长时间的实验也能如此。,Co-Sense for BA,何谓Co-Sense for BA用于分析生物样品的应用系统具有在线稀释旁通流路的自动前处理系统和新开发的前处理柱Shim-Pack MAYl-ODS的组合，实现了真正的血浆（血清）的直接大量注入。特长可对应蛋白质结合率高的药物使用样品导入用溶液的在线稀释的应用，即使是蛋白质结合率高的药物且在大量注入时 也可有效地捕集，回收率几乎100%。超高速进样和无限接近零的交叉污染。-使用高效自动进样器迅速且有效地除去蛋白有效地保护分析柱色谱柱和LC/MS的接口经久耐用的新型柱 通过采用新开发的涂覆技术和粒子径的最优化，可得到长期稳定数据。,自动前处理系统的基本流路,自动前处理系统的基本流路,通过对样品导入溶液进行最优化，可提高回收率。但是，为了提高浓缩效果而大量进样时的回收率会怎样呢？,血浆（血清）样品的大量进样时的回收率？,因大量进样，回收率降低。通过安装在线稀释旁通流路，可大量注入血浆（血清）样品。这便是Co-Sense的关键技术！,样品处理柱的容量,进样体积对色谱图的影响 当进样体积加大的时候，由于样品处理柱子容量的限制会发生峰展宽的现象.,100 uL,50 uL,10 uL,不同进样体积的影响,小体积进样的时候，预处理柱可捕集几乎所有的药物分子大体积进样的时候，部分药物被蛋白带走，回收率降低,在线稀释泵提高回收率的原因,在样品进入预处理柱之前，在线稀释泵可预先将蛋白和药物分子分离,Shim-pack MAYI-ODS（RAM）预处理柱,采用Shim-pack MAYI-ODS除蛋白,将硅胶（50m）的外表面用亲水性聚合物涂覆，只将细孔内部用十八烷基进行化学修饰。象蛋白质这样的高分子不能进入细孔内部，并被外表面的亲水性聚合物阻挡，不在固定相上保留，很快地洗脱。另一方面，诸如药物这样的通常的小分子化合物则浸透到细孔内部，被保留在内部表面的固定相上。,column name;Shim-pack MAYI-ODSpacking material;silica particleouter surface methyl celluloseinner surface octadecylsilyl groupparticle size;50mmcolumn size;4.6mm i.d.x 10mmpH range;2-7.5maximum pressure;20MPa,涂渍的甲基纤维素表面,药物,蛋白质,ODS 表面,预处理柱,Co-Sense for BA的流路构成,样品通过在线稀释旁通的作用，导入溶液自动稀释，被导入MAYI-ODS前处理柱。在除蛋白的同时，捕集、浓缩药物,Step1.除蛋白质的捕集浓缩,分析用高压梯度泵,分析柱,自动进样器,前处理柱,在线稀释旁通,导入样品泵,检测器,被MAYI-ODS捕集的药物，经阀切换，导入分析柱,Step 2.分析经浓缩的药物,导入样品泵,分析用高压梯度泵,分析柱,自动进样器,前处理柱,在线稀释旁通,检测器,在线自动稀释用旁通流路的效果,样品：消炎痛(1 mg/L)添加血浆样品导入液（稀释液）：0.1磷酸水溶液：乙腈=95：5注入量：500L稀释倍率：8倍检测：UV 315nm,用蛋白结合率较高的消炎痛进行评价无稀释旁通流路：回收率约50%。有稀释旁通流路：回收率几乎100%,自动浓缩带来的高灵敏度,样品：消炎痛(1 mg/L)添加血浆 无峰形歪斜样品导入液（稀释液）：0.1%磷酸水溶液：乙腈混合液（95：5）检测：UV 315nm,实现高灵敏度,实现高灵敏度的大量注入的稳定性捕集效率即使注入血浆500L，回收率也几乎达到100%。峰形状样品名：添加消炎痛的血浆,流动相(样品导入溶液)：100mM 醋酸钠缓冲液,血浆样品中药物回收率测定,在线自动稀释用旁通流路的影响,各药物在有稀释旁路下的回收率结果(spiked 2ug/mL each),Table.血浆样品中药物回收率(spiked 2ug/mL each,50uLinj.),样品导入溶液 pH值变化对回收率的影响,样品导入溶液对回收率的影响 1,Table血浆样品中各药物回收率结果(spiked 0.5ug/mL each(Naproxen:2ug/mL),50uLinj.),样品导入溶液对回收率的影响 2,样品导入溶液 离子强度变化对回收率的影响,Table Recovery of drugs in plasma(spiked 0.5ug/mL each(Naproxen:2ug/mL),50uLinj.),样品导入溶液对回收率的影响 3,样品导入溶液 乙腈溶剂添加对回收率的影响,出色的柱使用寿命,连续注入时的稳定性血浆基底的洗脱从稳定的MAYL-ODS洗脱蛋白质等血浆基底峰及回收率稳定的峰形状及回收率（几乎100%）,样品：添加异丙基安替比林的血浆注入量：100L样品导入液：0.1%磷酸水溶液乙腈混合液稀释倍数：8倍检测：分析；275nm，血浆基质；280nm,Co-Sense for BA-LCMS系统的特长,通过在Co-Sense for BA系统上连接LCMS-2010EV，成为更强有力的生物样品分析系统LCMS所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品的分析中，发挥威力。,何种化合物可用 LC/MS分析?,取决于化合物的离子化效率；化合物分子自身的极性，结构及其所含的功能基团等因素均会影响离子化情况；多数具有一定极性的有机化合物可以通过ESI 或APCI的方式离子化，如:药物及其代谢产物天然产物(生物碱,配糖物、苷glycosides,taxanes,毒素,糖类,脂类,维生素等等)蛋白质，多肽；杀虫剂，除草剂表面活性剂和染料,LC/MS的优势,强大的定性和选择性能力多组份样品的准确定性；未充分分离组份峰的鉴别；消除杂质干扰；可作为便捷的定性分析用于合成和衍生反应的研究；作NMR预分析的质谱鉴定；广泛适用于难挥发性化合物的分析扩展了大气压离子化的多种应用,对液相色谱分离组份进行强有力的定性确证,TIC色谱图 质谱图,强大的选择性,未充分分离峰的鉴别,椰子油的分析,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,17.5,min,0e6,10e6,20e6,30e6,40e6,50e6,60e6,Int.,m/z 467.5:C40 DB=1,m/z 495.5:C42 DB=2,m/z 523.5:C44 DB=3,TIC,高效液相色谱HPLC与质谱MS的接口技术研究始于1970s;大气压下的离子化API(atmospheric pressure ionization)于1987年商品化。大气压下的离子化接口:电喷雾离子化 Electrospray ionization(ESI)；大气压下化学离子化 Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI)；大气压下光离子化Atmospheric Pressure Photo Ionization(APPI),LC/MS离子化接口,高效液相HPLC,质谱MS,离子化接口,含缓冲盐的水/有机相；非挥发性的流动相Non-volatile,高真空状态分析离子（m/z）,大气压状态,低真空区域,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,机械泵 涡沦分子泵TMP1 涡沦分子泵TMP2,MS质量分析器,高真空区域,LC/MS系统硬件主要构造,离子源,离子化接口,大气压下的离子化API方法的优势,电喷雾Electrospray(ESI)适于极性样品的分析；推荐使用半微量流速，在雾化气条件下LC可实现高至 1ml/min的流速；用该种离子源能形成多电荷离子，扩展了所能检测的分子量范围；大气压下化学电离Atmospheric Pressure Chemical Ionization(APCI)低极性化合物；推荐使用半微量流速，在雾化气条件下LC流速可实现高至2ml/min；比热喷雾具有更好的稳定性；大气压下光电离Atmospheric Pressure Photo Ionization(APPI)弱极性和非极性化合物直接APPI离子化及掺杂物APPI离子化方式的正确选择,LCMS2010EV仪器结构特点,-干燥气体-保护,TMP 1,TMP 2,旋转泵,废液管,检测器,四极杆,前杆,入口镜,聚焦镜,八极,Q-阵列,Skimmer,保护阀,来自LC,雾化气体,ESI或APCI或APPI源,CDL,干燥气体,岛津QoQ设计,允许流速：0.0011 ml/min；操作温度：室温；雾化气流速N2：1.5 L/min,高电压,雾化气,大气压下的离子化(API)原理电喷雾离子化 ESI,ESI,液相流出组份,1)带电液滴,2)溶剂蒸发,3)离子蒸发,大气压下的离子化(API)原理大气压下化学离子化(APCI),高压放电针,离子-分子反应,允许流速：0.05 2 ml/min加热模块:400oC雾化气流速N2：2.5 L/min,APCI,液相流出组份,雾化气,大气压下的离子化大气压下化学离子化(APCI),LC 流份在雾化气作用下进入加热模块；流动相蒸发；高压放电条件下，质子化溶剂被离子化(产生反应离子)；4)样品和已产生的反应离子发生离子-分子反应生成质子化分子,离子-分子反应,Schematic diagram of APPI,ESI,APCI,APPI,polarity,Very polar,nonpolar,Molecular Weight,10,000,1,000,100,正离子或负离子模式采集数据?,质谱数据以正离子还是负离子模式采集，需考虑被测样品结构和特性等 由于C-O、C-N、双键、三键及碱性化合物具有较强的质子亲和力，上述基团或化合物更倾向于形成正离子；含COOH,-F,-Cl,-HSO3 的偏酸性化合物由于具有较强的质子给予能力，更倾向于形成负离子；还有许多化合物既可形成正离子，也能生成负离子；,LC/MS 2010EV的硬件结构,正交设计的离子源,加热的毛细管,Q-array,八极杆Octapole,四极杆质量分析器,检测器,离子转移,质量过滤,CDL(Curved Desolvation Line)单元和QoQ系统,QoQ系统是一套包含Q-阵列(Q-array)+八极杆透镜(Qctopole lens)+四极杆(Quadrupole)。这套离子光学系统是岛津公司集30年质谱设计、生产经验的结果，具有优异的离子传输和离子会聚性能。,QoQ 系统介绍,Q-array（Q-阵列）三排四极板平行排列，形成一锥形区域，使离子能被有效地引入八极杆。,Octopole Lens（八极杆透镜）八极杆透镜实现稳定的离子会聚,不易受系统真空变化的影响。,Quadrupole（四极杆）带有预杆的钼制双曲线四极杆系统作为 质量过滤器。预杆保护主四极杆免受污染，并延长使用寿命。岛津公司多年来 不断改进、优化四极杆系统的性能,最终实现优异的离子传输效率，质量数的稳定性和峰形。,Q,Q,O,Q-array中离子轨道示意图,上图显示具有不同入射角度的离子集穿过Q-array的轨迹。离子的运行路线被校正后，汇聚在中心的Skimmer入口处。这一离子运行轨道是依据Optdesign模型（岛津研发中心）计算优化得到的。,各种方向运动矢量的离子集,通过Q-array后的离子集，经会聚作用具有同一矢量,三排四极板成锥形平行排列，使离子被会聚于一狭窄区域。这与具有高频电压的四极杆工作原理类似。锥形设计提高了离子会聚能力，这也是提高灵敏度的关键。Performance of the Q-array and related optics is up to 10 times more sensitive than other designs.,典型的LC/MS质谱图,404,341,497,66,82,469,453,57,482,APCI正离子模式,APCI负离子模式,Co-Sense for BA-LCMS分析血浆样品,通过在Co-Sense for BA系统上连接LCMS-2010EV，成为更强有力的生物样品分析系统LCMS所具有的高选择性检测，在有复杂的基底的生物样品的分析中，发挥威力。,分析条件,SIM chromatograms of standards,each 1ug/mL,5uL,重现性,标准 血浆中的药物,倍他乐克95.0%普萘洛尔97.4%利多卡因94.0%狄布卡因107.7%布比卡因97.1%each 1ug/mL,5uL,n=5,回收率,1:倍他乐克r=0.999542:普萘洛尔r=0.999583:利多卡因r=0.999814:狄布卡因r=0.999785:布比卡因r=0.999860.01 1ug/mL,10uL,n=5,plasma spiked,1,2,3,4,5,校正曲线,提取液中含乙腈对回收率的影响,a.提取液:10mM 乙酸铵/乙腈=95/5b.提取液:10mM 醋酸铵,耐用性(Chromatogram),0.1mg/mL each,plasma spiked,Injection volume:50mL,Extraction time:2min,Column pressureat start time(MPa),Number of Injection,耐用性(柱压),Pump C for pretreatment,色谱柱:Shim-packVP-ODS（2.0mmi.d.150mmL）流动相:0.1%三氟醋酸/乙睛(8/2)流速：0.2mL/min导入液:10mM醋酸铵,LCMS与UV的比较-利多卡因的分析-,样品:添加利多卡因的血清（1mg/L）前处理柱：Shim-pack MAYI-ODS(4.6mmID10mmL)导入液：10mM醋酸铵注入量：10mL样品导入液流量：1mL/min稀释倍数：8倍,利多卡因的分析,(1 mg/L)標準試料注入量：2mL 导入液:10mM醋酸铵,线性关系,分析条件：前处理柱：Shim-pack MAYI-ODS(4.6mmID10mmL)导入液：10mM醋酸铵注入量：10mL样品导入液流量：1mL/min稀释倍数：8倍 样品浓度范围0.01,0.1,1.0mg/L,相关系数0.9996,检测：LCMS-ESI-(+)利多卡因,重现精度,利多卡因標準試料（1 mg/L）10 ml,分析条件：前处理柱：Shim-pack MAYI-ODS(4.6mmID10mmL)导入液：10mM醋酸铵注入量：10mL样品导入液流量：1mL/min稀释倍数：8倍色谱柱:Shim-packVP-ODS（2.0mmi.d.150mmL）流动相:0.1%三氟醋酸/乙睛(8/2)流速：0.2mL/min导入液:10mM醋酸铵 LCMS-ESI-(+),Co-Sense for BAMAYI-ODS柱的总结,高通用性通过采用在线稀释旁通，可广泛地对应蛋白结合率高的药物有效地除去蛋白质采用新开发的涂覆技术，实现稳定有效的除蛋白经久耐用通过粒子径的最佳化，提供长期可靠的数据与LCMS连接，更强有力的生物样品分析系统诞生MS强化药物鉴定功能,Thank you for your attention!谢谢！,