生物技术2班王淼.ppt

乙肝病毒研究,生物技术2班 王淼,危害人类健康的HBV,乙肝病毒探秘,乙肝病毒是较小的病毒之一，需在电子显微镜下放大几十万倍才能见到。乙肝病毒为直径42纳米（毫微米）的双层园形颗粒（医学上称戴恩氏颗粒），它的结构可比喻为一个鸡蛋，乙肝病毒的外衣如同鸡蛋的外壳，医学上把它称为乙肝表面抗原（HBsAg)；乙肝病毒的核心部分相当于鸡蛋中的卵黄，医学上称为乙肝核心抗原（HBcAg)乙肝病毒侵入人体肝脏时，把外衣扔在肝细胞膜外，而核心部分则长躯直入，在肝细胞核内开起了“病毒加工厂”。,显微镜下的乙肝病毒,乙肝病毒在肝细胞核内栖息繁衍（医学称为复制），分别复制出乙肝表面抗原与核心抗原，两者在肝细胞内又组装成新一代的乙肝病毒颗粒，并从肝细胞转移到血液中，随血液循环漫游全身各脏器。由于病毒外壳的复制多于病毒核心的复制，多余的外壳大量释放到血液中，即可检出乙肝表面抗原阳性。乙肝核心抗原因深藏在肝细胞里，或被表面抗原紧紧包裹，所以在血液中难以测到。但它常常将一个片段释放出来，医学上把这个片段叫做e抗原(HBeAg)。因此，乙肝病毒在肝内繁殖复制时，血液中可查出表面抗原、e抗原，以及机体针对核心抗原而产生的核心抗体（抗-HBc）。这三种标志物均阳性简称为“三阳”。,乙肝病毒对肝细胞并无直接损伤作用。肝细胞损伤与否，与人体的免疫功能有关。人体有清除异己、保护自身的抗病机构“免疫系统”。由于乙肝病毒核心部分盘踞在肝细胞核内，所以免疫系统要清除乙肝病毒，往往会同时破坏肝细胞。轻则表现为急性黄疸型或无黄疸型肝炎，重则表现为重症肝炎，反复发作则表现为慢性肝炎，成为肝硬化、肝癌的根源。一部分人的免疫系统与乙肝病毒“和平共处”，任其栖息繁衍，自生自灭，因而不产生免疫反应，肝细胞完整无损，肝功能正常，这就成为乙肝病毒携带者。,多数人感染乙肝病毒后，由于体内免疫系统的作用，逐渐产生能与表面抗原结合的抗体，即乙肝表面抗体（抗-HBs）。其作用是中和表面抗原，使病毒无法继续装配完整的病毒而繁殖下去因此，表面抗体阳性的出现，说明人体对乙肝病毒已产生了足够的抵抗力，并能防止乙肝病毒的再次感染和发病。人体感染乙肝病毒后，经4-24周潜伏期，即出现不同程度的临床症状及类型。大多数为无任何症状的隐性感染及仅有轻微不适的亚临床感染者，而出现明显肝炎症状的患者及成为慢性肝病毒携带者的仅为少数。乙肝患者的主要临床表现为肝区疼痛、肝脏肿大、黄疸、肝功能异常等。急性期一般持续1-2个月逐渐痊愈。但也有10-20%的病人可发展成慢性肝炎，其中少数发展成肝硬化或肝癌。,乙肝病毒特性,（）具有顽强的抵抗力 对热、对低温、对干燥、对紫外线及一般浓度的化学消毒剂，都能耐受；在零下度时可存活年；在度时可存活天，在度时仍然能存活小时，酒精、来苏儿、碘酒等对它不起作用。但是，加热到度分钟可使其失去传染活性，对过氧乙酸、漂白粉、新洁尔灭敏感。,（）的嗜肝性 一旦入侵人体，就要侵袭肝脏，并在那里定居繁衍后代，这就是它们的嗜肝性。据研究，这是因为肝细胞表面有一种“受体”的缘故，专门接受。大量集中于肝细胞内，并在其中复制，不断侵袭，诱发肝细胞发生免疫损伤。,（）的轻度泛嗜性 所谓泛嗜性就是非肝脏组织它也侵袭，比如胆管上皮细胞、胰腺上皮细胞、肾小管细胞、胃黏膜细胞及血液中的单核细胞等，侵入这些地方也可致病，如相关性肾炎、性糖尿病等。但这些泛嗜性并不一定会发生，很多人没有泛嗜性损害，所以说是“轻度”泛嗜性。主要还是侵袭肝脏。,（）严格的种属特性 到目前为止，只有人、黑猩猩、长臂猿、狒狒对易于感染，虽然在吸血昆虫体内检查到的踪迹，但只是暂时“居住”而已，一般不会在它们体内复制和增殖。,（）感染的慢性化 我国感染有明显慢性化倾向，特别是胎儿期及幼儿期感染，多为慢性化过程，长期携带，体内呈“免疫耐受”状态，不能将病毒清除，这个过程可长达年或更久，是重要的传染源。,（）的基因变异性 是极度易变异的病毒之一，它的四个基因组（、）均可变异，变异是病毒的特性，但往往给诊断和治疗带来困难。（）的致癌性 现在已经肯定，是肝癌的重要病因，约的肝癌有乙肝背景。有人观察发现，年乙肝病毒感染史者，约有发生癌变。癌变的原因是的基因整合到肝细胞基因上，发生突变，导致肝癌。,乙肝病毒复制之谜,在医学上，病毒的繁殖被称之为“复制”，这是因为它不像细胞和寄生虫那样通过细胞核分裂等方式繁殖，而是像我们铸造机器零件一样，按照一定的模具复制出来的。在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。,大量复制乙肝病毒,HBV长期携带者，如果HBV-DNA与肝细胞DNA发生整合，人体免疫卫士不能对其识别，不产生攻击和追捕。此类HBV患者，在治疗方案上：在积极提高自身免疫力的同时，还需打破免疫耐受。,乙肝病毒复制的“催化剂”叫做乙肝病毒DNA聚合酶(HBV DNA-P)。这种酶存在于乙肝病毒的内核，与乙肝病毒的核心抗原(HBcAg)、e抗原(HBeAg)和病毒基因(DNA)共同构成乙肝病毒的核心。它的作用就是催化乙肝病毒基因按照一定的模板复制出DNA链。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止。因此，抑制乙肝病毒DNA聚合酶的药物，即可直接抑制乙肝病毒的复制。,乙肝病毒复制的“原始模板”是cccDNA。这种原始模板是怎样形成的呢？乙肝病毒的基因组(DNA)是由两条螺旋的DNA链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA链要以负链为模板，在催化剂乙肝病毒DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。我们把这种DNA称做共价闭合环状DNA(即cccDNA)，似乎可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，按照模板的形状复制新的病毒基因就很容易了。病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA聚合酶的催化，一段基因又一段基因地复制，形成负链、正链。最后再装配到一起形成新的乙肝病毒DNA颗粒。,有人把cccDNA比做乙肝病毒复制的“种子”，我却认为把它比做“野草根”更为适合。俗话说：“拔草容易，除根难”，这种cccDNA是乙肝病毒复制中重要的中间产物，一旦它在肝细胞核内形成，就具有了高度的稳定性，可长期存在于肝细胞内，不但起着刚才所说的“模板”作用，而且还像深深扎根在泥土里野草一样很难完全清除。不论用什么抗病毒药物，不论胞浆内的DNA受到多大的抑制，也不论用药的时间有多久，均很难清除这种cccDNA。只要肝细胞内有很少量的cccDNA，当停药后，核内的cccDNA又可再次成为病毒复制的模型，继续复制乙肝病毒的DNA。这样就造成了一些抗病毒药物停药后的“反跳现象”。,乙肝病毒复制也有“冬眠”的时候。当感染机体的乙肝病毒处于e抗原阴性、e抗体阳性的“小三阳”状态时，就是乙肝病毒复制的冬眠期。这时，乙肝病毒几乎无复制，它的野草根cccDNA深深地隐藏在肝细胞核内处于休眠状态。但这种状态的病毒还可能“复活”，可能由于某种因素诱发其重新转变为e抗原阳性的病毒复制状态。在乙肝病毒的冬眠期，病人的病情相对平稳，传染性也很小，但目前所有的抗病毒药物也对藏在细胞深处的休眠病毒基因也奈何不得。因此，在这一时期使用何种抗病毒药物都是徒劳的。人类从发现乙肝病毒颗粒，到解开病毒复制之迷，又到现在抑制病毒DNA聚合酶药物的发现，一步一步地前进。相信不久，斩草除根的药物、对抗“冬眠期”病毒的药物将会出现，人类终究会战胜乙肝病毒的一顽敌。,HBV在体内持久携带，易导致免疫功能紊乱，警惕肝脏相关疾病发生。因此无论有无症状都需要定期检查。,乙肝病毒感染病毒模型研究新进展,体外模型体内模型,一、体外模型乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染有高度的种属和组织特异性，它只感染人和类人猿。其原因是病毒黏附以及病毒DNA转录及复制对细胞有严格的要求1。体外培养的人和类人猿原代肝细胞可以支持HBV的复制，但细胞维持时间不长。能在体外长期培养的肝源性肿瘤细胞株2.2.15是应用最广泛的乙型肝炎细胞模型。将含有HBV基因组（个HBV头对尾二聚体，以尾对尾方向串联）的重组载体质粒转染HepG2细胞，经G418筛选，得到的克隆能稳定分泌HBsAg、HBeAg及Dane颗粒，可检测到细胞内DNA和RNA，但无cccDNA细胞模型存在的问题是：HBV是整合在宿主细胞染色体上，复制方式与自然感染不同，且不能被清除；病毒复制的水平不能人为改变；病毒复制水平低。,为克服HBV的细胞膜屏障，人们借用其他病毒的感染能力，把HBV导入到靶细胞。Delaney等2报道了一种抗HBV药物体外筛选系统，即HBV-杆状病毒-HepG2系统。利用杆状病毒Autographa California将具有复制能力的HBV基因组导入到HepG2细胞，检测到高水平的HBV表达，包括细胞内和细胞外HBV DNA和RNA，以及cccDNA和各种HBV抗原。病毒表达的水平和病毒的感染量（MOI）有量效关系。该系统可以控制感染的时间，在病毒复制期间或之前对细胞进行处理。用该系统对拉米夫定的药效进行评价，发现拉米夫定可以减少细胞内复制中间体和细胞外HBV DNA,而且可以抑制cccDNA的表达，这在以前的系统中是不能观察到的。拉米夫定的作用有剂量和时间依赖性3。他们还用此模型检测了药物对HBV变异株的作用4。,但是，杆状病毒系统也有缺陷：(1)杆状病毒进入哺乳动物细胞是通过非特异的内涵体摄取而不是受体介导方式；(2)杆状病毒感染的每个细胞内有多个HBV拷贝；(3)杆状病毒介导的基因转移限制在一定的种属，更重要的是不能作为动物体内实验的方法。He等5采用Ad-HBV1.3-HepG2系统以腺病毒为载体，将1.3倍的HBV转入包装细胞，再将包装好的病毒感染HepG2细胞，可以产生高水平的HBV表达。该系统利用细菌内同源重组法5，将具有同源性的两个质粒pAdEasy和pAdTrack-CMV共转化E.coliBJ5183细胞，使腺病毒载体和目的基因HBV1.3连为一体。HBV1.3除含完整HBV基因组外，在5端还多余一段HBV序列，即ENHI和ENHII,X ORF.Poly A1,转基因小鼠实验证实HBV1.3比HBV1.1和HBV1.2更高地表达HBV6。质粒pAdEasy含有不完整的腺病毒Ad5基因，缺失E1区(1-3533)和E3区(28130-30820)，E1区对于病毒复制是必需的，293细胞可以补充E1区。质粒pAdTrack-CMV含有目的基因HBV1.3,CMV 启动子，绿色荧光蛋白基因（GFP），卡那霉素Kan,Pacl位点，pmel位点，在pmel两侧分别为两臂，左臂含Ad5第34931-35935核苷酸，右臂含Ad5第3534-5790核苷酸，两臂介导和pAdEasy的同源重组。将pAdTrack-CMV用pmel酶线性化后，和环状的pAdEasy共转化E.coliBJ5183细胞，利用卡那霉素抗性筛选重组体，再用限制酶 pacI.speI.BamH1消化证实；重组成功的质粒用pac1线性化，然后用脂质体法转染包装细胞293(人胚肾细胞)。观察绿色荧光蛋白的表达，可以计算转染的效率。,该载体具有以下优点：()含有大部分腺病毒基因组序列的腺病毒骨架质粒，于超螺旋形式应用而不需要进行酶切处理；()重组是在具有高效同源重组机制的细菌内进行而不是哺乳动物细胞内，省掉了连接的步骤；()可以插入达10kb的目的基因，而且可以在同一病毒内插入多个基因；()腺病毒骨架质粒上整合了绿色荧光蛋白基因，可以直接观察转染和感染效率，使得腺病毒监测问题变得更容易5。Sprinzl等7利用AdHBV1.3，将293细胞包装好的病毒感染数种原代肝细胞和HepG2细胞，获得成功。分别用Ad-HBV1.3感染人原代肝细胞，小鼠肝细胞，大鼠肝细胞，树鼠句肝细胞，以及鸭肝细胞和HepG2细胞，应用Southern杂交检测出细胞内HBV DNA，cccDNA,用northern杂交检测到3.5kb、2.4kb和2.1kb的HBV RNA。用western blot 检测到HBV各种抗原。应用斑点杂交方法检测到培养基或血清中的HBV颗粒。该系统使HBV可以感染跨种的多种细胞，包括小鼠，大鼠，树鼠句肝细胞，甚至包括禽类的鸭肝细胞。以DHBV代替HBV也能得到相似的结果。和2.2.15系统相比，它具有高效转移、表达HBV，可对HBV突变和表达进行人为控制等优点；和杆状病毒系统相比，它不存在种属障碍，可以用做体内实验，而且表达水平更高。,二、体内模型类人猿和黑猩猩作为HBV感染模型已得到公认，但价格昂贵，难以推广。土拨鼠肝炎病毒（WHV）慢性感染的土拨鼠可以发展为严重的肝炎和肝肿瘤，和人感染HBV后的发病过程非常相似。给新生的土拨鼠接种WHV,可获得慢性WHV感染土拨鼠模型。慢性WHV携带的土拨鼠平均寿命为29个月，最后几乎全部都发展为肝肿瘤。土拨鼠还可作为抗病毒药物临床前评价的工具，研究药物的药效、药物动力学以及毒理，也可用作评价免疫治疗的疗效8。用土拨鼠的局限是：它们感染的肝炎病毒为WHV，和HBV有一定差异，使对乙型肝炎的发病机理和机体应答的研究受到限制。,研究发现树鼠句可以感染HBV，严瑞琪等9发现HBV感染树鼠句HBsAg血症者47%，平均持续7周，HBV DNA阳性率51%，持续41周以上；肝细胞HBV DNA阳性率67%，并存在复制型HBV DNA。用感染HBV树鼠句的血清可连续传代感染。但国外报道有所不同，将新生树鼠句和成年树鼠句腹腔接种HBV阳性患者的血清，都在血清中检测到HBsAg,24周后血清中检测到抗HBs,抗HBc，抗HBe，而HBsAg消失，类似急性肝炎的病程。说明在树鼠句感染HBV是一过性的，HBV的复制和表达水平不高。,Sprinzl等7利用Ad-DHBV1.3系统，将293细胞包装好的病毒颗粒以尾静脉接种小鼠，5d后处死小鼠，8只小鼠中有7只肝脏中用Southern blot检测出复制型DHBV,用PCR检测出所有小鼠的血清中有DHBV,都没有腺病毒DNA。用这些鼠的血清可以感染原代鸭肝细胞，并且和DHBV阳性鸭的血清感染效率相当。说明DHBV也可以通过腺病毒转移到小鼠肝脏并支持DHBV体内复制。近年来HBV转基因小鼠受到重视。将HBV目的基因显微注射到小鼠的受精卵，产生稳定整合HBV的小鼠。在目的基因的选取上，可以是HBV全长或超过其基因组的1.3倍HBV，也可以是HBV片段，如前s、s、c和x基因，用于研究各基因及其表达产物在HBV生活史中的作用。HBV转基因小鼠不仅可以研究HBV感染过程和感染后的免疫病理改变10，还有助于发展新的抗病毒治疗方法。,HBV转基因小鼠实验发现在慢性HBV携带者由于一种抗原提呈细胞（树突状细胞）的功能缺陷和缺乏一些必要的细胞因子，不能有效提呈HBsAg,不能清除病毒，导致持续感染11。但是在所有的HBV转基因小鼠都不能检测到细胞内cccDNA,而cccDNA是前基因组及各种长度RNA的转录模板，在HBV的复制过程中起着非常重要的作用，而目前抗病毒治疗主要是在反转录和复制水平抑制病毒DNA，而且HBV是整合在宿主染色体上的，没有经过和靶细胞受体结合穿透的过程，与自然感染不同，应用也受到限制。,为克服转基因鼠的缺陷，人们寻求一种模拟HBV自然感染的动物模型。Dandri等12将UPA转基因小鼠和RAG-2基因剔除小鼠杂交，得到的后代被移植入人肝细胞。由于UPA是一种纤维蛋白酶原激活剂，它选择性地在肝细胞表达，使肝细胞中的蛋白质水解，造成UPA小鼠体内肝细胞持续损伤，产生肝再生刺激信号，有利于外源肝细胞的存活。而RAG-2基因剔除小鼠由于缺失重组活化基因RAG-2,T细胞和B细胞不能成熟,不具备完整的体液和细胞免疫功能，对外源肝细胞不排斥。二者杂交的后代兼有以上两种特征，可以支持HBV感染和表达。实验中采用脾内注射人肝细胞悬液，在小鼠血清和肝脏中均检测到HBV各种抗原和复制中间体。该模型可以用于HBV感染过程和治疗的研究，以及肝癌的发生机理，但因采用的是免疫缺陷鼠，不能作为机体和病毒相互作用特别是免疫清除机理的研究。另外，人肝细胞移植的效率很低，只占小鼠肝脏的15%，而采用同样的方法移植土拨鼠肝细胞，则可占小鼠肝脏的90%以上，可能和移植肝细胞的活力高低有关。,从已有的HBV体内外模型看来，Ad-HBV1.3-HepG2系统是较为理想的，可以用做体内体外实验，研究HBV的生物学，判断抗乙型肝炎药物及其他治疗手段的疗效，但是不能用作研究病毒黏附，致癌机制等。HBV体内体外模型还需要进一步探索。,乙肝病毒四种传播途径,母婴传播血液传播性接触传播日常生活接触传播,母婴传播 在我国，母婴传播是造成人群乙肝病毒高携带率的主要因素。孕妇若是乙肝病人或乙肝病毒携带者，就可通过胎盘、分娩过程中的母血、羊水或产后的乳汁、唾液等将乙肝病毒传染给自己的孩子，这就是通常所说的母婴传播。乙肝母婴传播可以发生在分娩过程中，因为孕妇的血液和子宫颈、阴道分泌液中都含有乙肝病毒，胎儿分娩时或因胎盘剥离、绒毛破损，母血可直接向胎儿渗入，再因新生儿皮肤矫嫩，分娩时可能有擦伤，经接触或吞咽产道中的血和分泌物而感染。剖腹产也不能幸免，因剖腹产时也有胎盘剥离过程，胎儿也要通过含有母血的子宫切口。此外，产后在喂养过程中，也可造成乙肝病毒感染，因为母乳及其唾液中都可含有乙肝病毒。目前研究通过对乙肝病毒（HBV）进行分子水平的研究，证实孕妇被感染的单个核细胞可通过胎盘传给胎儿的传播机制，进一步说明，HBV宫内感染是母婴间传播的最主要途径，目前的措施难以阻断对新生儿的感染。,血液传播 乙肝病毒通过输血、注射及伤口污染等途径传播。如果献血者为乙肝病毒携带者，就会通过输血使受血者感染乙肝病毒。现已证明，只要给人注入千万分之一毫升具有乙肝传染性的血液，即可引起感染，注入万分之一毫升就会发病。因此，乙肝病人或病毒携带者使用过的注射器，如果没有严格消毒或仅换一个针头而不换针筒再给他人注射，就会造成传染。尤其在街头拔牙、耳垂穿孔、纹身等，由于器械未经彻底消毒而传播乙肝的危险性最大。此外，与他人共用牙刷、剃须刀也容易传播乙肝病毒,性接触传播 乙肝病人或病毒携带者的唾液、精液、阴道分泌物均含有乙肝病毒，因此，夫妻中一方带乙肝病毒时，可通过性生活传给对方；性乱和卖淫嫖娼者更易传播。,日常生活接触传播 在家庭、学校内和集体生活过程中，因密切接触乙肝病人或病毒携带者而引起传播。当含有乙肝病毒的唾液、汗液、尿液、精液、月经血、阴道分泌物和鼻腔分泌物等体液污染了食具、茶具、牙刷、手帕、衣服、钞票等，均可引起乙型肝炎的传播。,抗击乙肝，任重而道远,让我们一起携手,共抗乙肝，关爱乙肝患者,