生物学实验技术第一二章.ppt

现代生物学试验技术,王 希 朝,第一章 绪论,生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因：,（1）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化；（2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。,生物技术将是未来经济发展的新动力第一次技术革命工业革命解放人的双手第二次技术革命信息技术扩展人的大脑第三次技术革命生物技术改造生命本身,生物技术的显著特点高技术（精细和密集的复杂技术）高投入（尤其是前期科研投入高）高利润,1982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品为社会服务的技术。美国政府技术顾问委员会(OAT)的定义是：应用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术，其还包括改良有重要经济价值的植物与动物和利用微生物改良环境的技术。该定义强调了生物技术的商品属性。,1、生物技术的定义、主要内容和发展概况,生物技术的定义,现代生物技术包括,1、基因工程2、细胞工程3、蛋白质工程4、发酵工程5、酶工程6、生物化学工程7、生物医学工程8、.,基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程此外还有基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术直接相关联的学科：分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、化学工程学、医药学等。对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术,生物技术的主要内容,“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。,2、蛋白质工程、发酵工程和细胞工程简介,蛋白质工程,蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;,蛋白质工程,（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。,发酵工程,发酵工程,一般发酵工程包括以下基本步骤：（1）菌种选育；（2）细胞大规模培养即发酵过程；（3）生产活性的诱导；（4）菌体及产物的收获,发酵工程的产品范围非常广泛。从食品、药品、精细化工产品到许多工业用原料、可降解塑料PHB等。,细胞工程,细胞工程是指通过细胞水平上的筛选或改造，获得有商业价值的细胞株或细胞系，再通过规模培养，获得特殊商品的技术与过程。细胞工程包括动物细胞工程和植物细胞工程，它们分别以动物细胞和植物细胞为主要生产对象，以细胞培养为主要过程和内容。,动物细胞培养,细胞工程,单细胞藻类培养,细胞工程,一些单细胞低等植物如单细胞藻类的大规模培养成为细胞工程的重要组成部分获得蛋白质资源、营养食品、精细化工产品等等,高等植物细胞培养,细胞工程,高等植物细胞具有全能性。从高等植物的幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱导生成完整的植株。,细胞融合、细胞重组,细胞工程,细胞融合是将不同种类的两种细胞经过特殊处理后放在一起，在某些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞。,细胞重组是把不同种类的细胞的部件重新组合装配，包括核的移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等。,生物技术的安全性和社会伦理问题,基因一旦被改动，一方面可能引起生物体内一系列未知的结构与功能的变化；另一方面，转基因操作对生物体的影响会通过遗传传递。,转基因技术的安全性问题,外源基因引入后，是否会影响其他重要的调节基因，甚至会激活原癌基因？转基因技术的广泛应用是否会导致难以消灭的新病原物出现？是否会造成生态学灾难？人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康？,克隆人的伦理问题,在克隆阶段，如果有关胚胎发育的基因重新编排或启动不完全，对新生儿可能产生什么严重后果呢？兄弟、姐妹、父母、子女？器官克隆和干细胞培养和分化器官，用于医学和临床治疗？,个人基因信息的隐私权问题,人类基因信息利用的伦理、法律和社会影响计划，称之为ELSI项目：（1）在应用和解释基因信息时的隐私权和公正性；（2）基因信息由实验室研究向实际医疗应用的转化；（3）人类基因组计划参与者相互协调和成果发布；（4）公众与专业教育,基因治疗的应用问题,一个人有权决定另一个人的基因结构或未来命运吗？万一这种基因操作失败了或者造成了将来才能发现的不可挽回的缺陷和后果，谁承当责任呢？是否可以通过基因治疗操作来增加运动员的身高或短跑速度，这与运动员服用兴奋剂有什么本质区别？,生物技术引发的其它问题,生物技术费用高，在自身健康上的贫富差距？涉及人类自身发展的重要生物技术的垄断？生物武器？,第二章 细胞培养,细胞培养所用玻璃及塑料品的清洗与消毒,清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗,玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹不能残留任何物质,浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水简单刷洗，然后晾干，再浸酸再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上,刷洗,用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质透明的塑料制品刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度,浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中,清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）强清洁液 631000200000 次强清洗液 1202001000 弱清洁液 100100100配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色,冲洗,在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹最好用洗涤装置如用手工操作需流水冲洗二十次，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，三蒸水清洗3次，晾干或烘干备用,胶塞的清洗,新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用,塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品必要时用2%NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用,消毒,细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染,消毒灭菌方法,物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min湿热（高压蒸气灭菌法）：121，20min干烤：160,2 小时过滤：0.22m化学消毒灭菌法70%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染,化学消毒法,70%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒,细胞培养常用物品,细胞培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F10等,血清,热灭活：56,30 分钟加热已完全解冻的血清热灭活目的：灭活血清中的补体成分。除非必须，一般不建议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5 分钟去除，也可不用处理显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清,平衡盐液体,组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分用于洗涤组织、细胞等,PBS（Phosphate-Buffered Sallines）KCl 0.20gKH2PO4 0.20gNaCl 8.00gNa2HPO47H2O 2.16gDPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）标准型CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙)0.10gKCl 0.20gKH2PO4 0.20gMgCl26H2O 0.10gNaCl 8.00gNa2HPO47H2O 2.16g,Hanks 平衡盐溶液（Hanks Balanced Salt Solutions，HBSS）CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙)0.14gKCl 0.40gKH2PO4 0.06gMgCl26H2O 0.10gMgSO47H2O 0.10gNaCl 8.00gNa2CO3 0.35gNa2HPO4 0.048gD-Glucose 1.00gPhenol Red 0.01g,D-Hanks 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions,D-HBSS)KCl 0.40gKH2PO4 0.06gNaCl 8.00gNaCO3 0.35gNa2HPO4 0.048gD-Glucose 1.00gPhenol Red 0.01g,消化液,分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液单独或混合使用,胰蛋白酶溶液,主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用,胰蛋白酶溶液配制称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25%（0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右保存条件：配制好的胰蛋白酶溶液必须保存在-20冰箱中，以免分解失效,EDTA4Na 溶液,一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。通常与0.25%的胰蛋白酶溶液按1：1 混合使用（混合液）注意：使用EDTA 处理细胞后，要用Hanks 液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长EDTA 溶液配制：用D-Hanks 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4冰箱保存,pH 调整液,NaHCO3 溶液常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存HEPES（分子量238.31）溶液使用终浓度一般为10-50mM常配成1M 储存液：用200ml 双蒸水溶解47.6克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存,酚红,大多数培养液中使用酚红作为pH 指示红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用,抗生素溶液,抗生素使用种类与浓度：工作浓度 储存温度 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml-20 G(+)streptomycin 100 ug/ml-20 G(+)、G(-)gentamicin 50 ug/ml-20 G(+)、G(-)、支原体amphotericin B 2.5 ug/ml-20 真菌nystatin 50 ug/ml-20 真菌,器材和液体的准备,细胞培养用的玻璃器材培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160，2小时干烤灭菌后备用手术器材、瓶塞、配制好的PBS液15磅，121，20分钟蒸气灭菌MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用,无菌操作中的注意事项,在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70%ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用 在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行,哺乳动物细胞冷冻保存,冷冻保存要点冷冻过程要缓慢。4 3060 分钟-20 30 分钟-80 1618 小时（或过夜）液氮长期保存冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。细胞浓度控制在：11075107/ml。常用细胞冷冻保存液10DMSO 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液）10甘油 完全细胞生长培养液（20血清基础培养液）,冷冻保存细胞的解冻与复苏要点,快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中,解冻冷冻保存细胞的离心方法,从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37水浴中快速解冻将12ml 冻存细胞液加入到25ml 新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀用80g 离心23 分钟，弃上清液用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞接种细胞到培养瓶中，起始密度为3105/ml。,细胞的原代和传代培养,原代细胞培养原理,细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养,原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）,取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清消化、接种培养：加入0.25胰蛋白酶一0.02EDTA混合消化液（510倍量），与组织块混匀。置37水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入510ml完全生长培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养,原代细胞培养结果,细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层,传代细胞培养原理,体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增36次,传代细胞培养操作,将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置510分钟在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入35ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养,传代细胞培养结果,一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，24天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代,细胞培养常见问题解答,培养液pH 值变化太快CO2 张力不对按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5 到10改用不依赖CO2 培养液培养瓶盖拧得太紧松开瓶盖1/4 圈NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度 培养液中盐浓度不正确在CO2 培养环境中改用基于Earles 盐制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液细菌、酵母或真菌污染丢弃培养物或用抗生素除菌,培养液出现沉淀，但pH值不变,用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌冰冻保存培养液将培养液加热到37，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液,培养液出现沉淀，同时pH 发生变化,细菌或真菌污染丢弃培养物抗生素除菌,培养细胞不贴壁,胰蛋白酶消化过度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度支原体污染分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物培养液中无贴壁因子,原代细胞培养物污染,原代培养组织在进入培养前已污染培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织,培养细胞生长减慢,由于更换不同培养液或血清比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验增加起始培养细胞浓度培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子培养物中有少量细菌或真菌污染用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。试剂保存不当血清需保存在-5 到-20。培养液需在28避光保存。含血清完全培养液在2-8保存，并在2 周内用完,The End!,