生物化学经典实验-酵母RNA的提取与鉴定.ppt

酵母RNA的提取与鉴定,实验目的,掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。,实验原理,由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。苯酚法是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。,实验原理,酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%0.516%,为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。,稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。,实验原理,RNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。RNA在酸性条件下，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作催化剂。,本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破裂，又可增大 RNA的溶解度。当碱被中和后，可用乙醇将RNA沉淀，此为 RNA的粗品。样品中少量脱氧核糖核酸(DNA)存在对鉴定无干扰，蛋白质、粘多糖可干扰鉴定。,试剂的配制,地衣酚(苔黑酚)三氯化铁试剂 将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl36H2O(或等量CuO)。此液需临用时配制。,实验步骤,1、酵母RNA的提取 称5g干酵母粉于150 ml三角烧瓶中，加50ml 0.2的 NaOH，沸水浴中搅拌提取30 min。冷却后滴加乙酸使其略偏酸性(pH56)。离心(4000 rmin，15 min)，去除沉淀。向上清液中加入30 ml 95乙醇，稍搅拌后静置。待完全沉淀后离心(4000 rmin，15 min)，去上清液。沉淀加10 ml 95乙醇，搅拌后再次离心。沉淀再依次用10 ml的无水乙醇、乙醚(2)洗涤,得RNA粗品。,2RNA的鉴定 取沉淀约0.2 g，加2 ml 10H2SO4沸水浴中加热2 min加1.5 ml地衣酚试剂沸水浴中加热观察颜色变化。,实验步骤,注意事项,稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。利用等电点控制RNA析出时，应严格控制pH。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。,