生物化学第二章核酸化学2-性质研究方法.ppt
主讲教师：季祥邮箱：,第二章 核酸化学,核 酸,2.4 核酸的理化性质,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.4 核酸的理化性质,核酸的性质是由其结构决定的。核酸的结构特点是分子大,有一些可解离的基团,具有共轭双键等.这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性质的基础.下面介绍几种重要的性质:,2.4 核酸的理化性质,一、物理性质,1、性状：RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。2、溶解性：RNA和DNA都是极性的化合物，一般说来，这些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。DNA和RNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DNA核蛋白与RNA核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。DNA蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1mol/L的NaC溶液中溶解度比纯水高2倍，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解；而RNA蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L的NaCl溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。3、粘性：核酸的水溶液粘度很大，粘度DNA大于RNA。核酸变性后，粘度下降。,2.4 核酸的理化性质,二、核酸的水解,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,三、核酸的两性电离与等电点,核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为45，RNA的pI约为2.02.5，在pH78电泳时泳向正极。,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,四、UV吸收：核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质，在260nm处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,五、DNA的变性、复性与分子杂交,DNA双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释DNA的重要特性变性与复性，这对于深入了解DNA分子结构与功能的关系又有重要意义。,（一）DNA变性(denaturation),1、DNA变性的概念：指DNA分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。2、DNA变性的本质：维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。3、导致DNA变性的因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,4、变性DNA的特征：,（1）溶液粘度降低：DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后转化成柔软而松散的无规则单股线性结构，因此粘度明显下降。（2）旋光性发生变化：变性后整个DNA分子的对称性及分子构型改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。（3）紫外吸收增强。,增色效应(hyperchromic effect)：指DNA变性后其紫外吸收明显增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。,2.4 核酸的理化性质,对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定高度时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。若以温度对DNA溶液的紫外吸光率作图，得到的典型DNA变性曲线呈S型如上图所示。,可见，DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称融解温度(Tm,melting temperature)。在Tm时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的Tm值与其GC所占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表示为：,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,Tm=69.30.41(G+C)%,一定条件下(相对较短的核酸分子)，Tm值大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；另外，溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也较宽，反之亦然，因此DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,(二)DNA的热变性与复性(renaturation),指经加热变性的DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响：,1、温度和时间：一般认为比Tm 低25左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。,2、DNA浓度：溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利于复性。,2.4 核酸的理化性质,3、DNA顺序的复杂性：,简单顺序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补，则困难得多。,在核酸复性研究中，定义了一个Cot的术语，(Co为单链DNA的起始浓度，t是以秒为单位的时间)，用以表示复性速度与DNA顺序复杂性的关系。在探讨DNA顺序对复性速度的影响时，将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定，以不同复杂程度的核酸分子重缔合部分(在时间t时的复性率)对Cot作图，可以得到如图下图所示的曲线：,2.4 核酸的理化性质,不同物种核酸的Cot曲线：,2.4 核酸的理化性质,曲线上方为示复杂性的核酸分子的非重复碱基对数。如多聚(A)的复杂性为1，重复的(ATGC)n组成的多聚体的复杂性为4，分子长度是105核苷酸对的非重复DNA的复杂性为105。,原核生物基因组均为非重复顺序，故以非重复核苷酸对表示的复杂性直接体现基因组大小(图上方的箭头所指为基因大小)，对于真核生物基因组中的非重复片段也是如此。在标准条件下(一般为0.18ml/L阳离子浓度，400核苷酸长的片段)测得的复性率达0.5时的Cot值(称Cot1/2)，与核苷酸对的复杂性成正比。对于原核生物核酸分子，此值可代表基因组的大小及基因组中核苷酸对的复杂程度。真核基因组中因含有许多不同程度的重复序列(repetitive sequence)，所得到的Cot曲线更为复杂。,2.4 核酸的理化性质,DNA的变性和复性原理，现已在医学和生命科学上得到广泛的应用。如核酸杂交与探针技术，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术等。,2.4 核酸的理化性质,（三）分子杂交：(hybridization),不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的杂化双链(heterodup lex)，这个过程称为杂交(hybridization)。,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,杂交可以发生于DNA与DNA之间，也可以发生于RNA与RNA之间和DNA与RNA之间。,例如，一段天然的DNA和这段DNA的缺失突变体(假定这种突变是DNA分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双链中部鼓起小泡。测定小泡位置和长度，可确定缺失突变发生的部位和缺失的多少。,2.4 核酸的理化性质,核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来检验核酸的缺失、插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中的关系，其主要应用如下图所示：,2.4 核酸的理化性质,核酸杂交及其应用示意图.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链.突变体的鉴别。B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线框内是已缺失的部分；D是显示从天然DNA链鼓出小泡.粗线代表探针，粗线上的X表示放射性标记,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,2.4 核酸的理化性质,在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称探针技术(Probe)。,探针技术在遗传性疾病诊断上已开始应用。例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取DNA，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还可以发现一些没有症状的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量DNA后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。,杂交和探针技术是许多分子生物学技术的基础，在生物学和医学的研究中，以及临床诊断中得到了日益广泛的应用。,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,一、分离核酸的一般原则,因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。,保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。,（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则：,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,（二）核酸的纯度要求,核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,（三）核酸分离纯化的注意事项,为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：,尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH410条件下进行；防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素；,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。,机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为04以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,二、核酸分离纯化的一般步骤,破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干燥溶解,核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。,细胞内总DNA的提取分离程序,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,三、核酸的测定方法,1、紫外吸收法,在一定pH下测定样品的紫外吸光度（A260），即可由下式计算样品中的核酸含量：,C=MrA260/L,其中：C为核酸的含量（mg/mL），Mr为相对分子质量，A260为核酸溶液的吸光度，为摩尔消光系数（即1升溶液中含1摩尔核酸的光吸收值），L为比色杯的内径（cm）,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2、定糖法,RNA的测定：RNA分子中所含的核糖经浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛，糠醛可与3，5-二羟甲苯（苔黑酚或地衣酚）反应生成绿色化合物，该化合物可在670-680nm波长下进行比色测定。DNA的测定：DNA分子中的脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺反应生成兰色化合物，该化合物可在595-620nm波长下进行比色测定。,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,3、定磷法,RNA和DNA中都含有磷酸，可以进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，测出核酸中的磷含量就可计算核酸的含量。测定时先将核酸用强酸消化成无机磷酸，后者与定磷试剂中的钼酸反应生成磷钼酸，在经过还原作用而生成蓝色的复合物，最后在650-660nm进行比色测定。,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,四核酸研究方法,（一）核酸的沉降特性,溶液中的核酸在引力场中可以下沉。在超速离心机造成的强大的离心力场中，核酸分子下沉的速度大大加快。核酸的超速离心用于：,1、测定核酸的浮力密度；2、测定DNA分子中的G、C含量；3、测定溶液中核酸的构象，核酸经染料氯化铯密度梯度离心以后，在离心管里，沉降的速度由大到小依次为：超螺旋DNA、闭环质粒DNA、开环及线型DNA，若样品中含有蛋白质，蛋白质沉降速度最小。4、核酸的制备。,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,（二）核酸的凝胶电泳,凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法，有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者常用于DNA的分离分析，后者用于RNA的分离分析。,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,五、核酸的序列测定,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,DNA的一级结构的测定方法,1.Sanger双脱氧链终止法(酶法测序）,DNA的合成总是从5端向3端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引物链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3,5磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列,如下图所示：,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.MaxamGilbert DNA 化学降解法,(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列,如下图所示：,这一方法的基本步骤为:,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,化学裂解法测定DNA的核苷酸序列,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,六、PCR基本原理,核 酸,2.4 核酸的理化性质,2.5 核酸的分离纯化、测定及研究方法,
