生物化学教程蛋白质的性质.ppt

第五节 蛋白质的重要性质,（一）蛋白质的两性解离和等电点（pI）（二）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（三）蛋白质的变性（四）蛋白质的水解（五）蛋白质的颜色反应,（一）蛋白质的两性解离和等电点（pI）,、两性解离、蛋白质的等电点（pI）、电泳,、两性游离,NH3+Pr COOH,NH3+Pr COO-,NH3 Pr COO-,OH-,OH-,H+,H+,阳离子,阴离子,兼性离子,（pHPI）（pH=PI）（pHPI）,、蛋白质的等电点（pI）,当溶液处于某一pH值，蛋白质分子所带正、负电荷相等，净电荷为零，呈兼性离子状态，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点（pI）。不同的蛋白质，其等电点（pI）不同。pI是蛋白质的特征性常数。利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。,几种蛋白质的等电点（pI）,蛋白质名称 来源 pI 血清蛋白 人血 4.64肌球蛋白 肌肉 7.0 胃蛋白酶 猪胃 2.83.0胰蛋白酶 胰液 5.0卵清蛋白 鸡蛋 4.84.9白明胶 动物皮 4.8,、电泳,带电颗粒向与其电荷相反的电极方向移动。意义：用于蛋白质的分离、纯化鉴定和分子量的测定。血清蛋白电泳图谱：,清蛋白,1,2,球蛋白,电泳 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,电泳方法：,自由界面电泳,区带电泳,纸电泳凝胶电泳,圆盘电泳平板电泳,（二）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀,1、蛋白质是高分子化合物，分子量多在1万100万之间。2、球状蛋白质的颗粒大小达1100 nm范围，故蛋白质有胶体性质。蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体。3、蛋白质分子大，不能透过半透膜。4、蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心，可发生沉降。,蛋白质的胶体性质,颗粒大小：在1100nm之间。属胶体。因此溶于水，成为亲水胶体。稳定亲水胶体的因素：水化膜 表面电荷 不通透性：半透膜 透析的原理：,透析,将蛋白质溶液(不纯)放入透析袋中，放在流水中（纯水），让低分子杂质（如盐类）透过半透膜扩散入水内，蛋白质则留在袋中，分离纯化蛋白质。,半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。,沉降作用,1、沉降概念：蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，离心管底部的蛋白质浓度增高。2、沉降速率：在离心时，蛋白质分子在单位时间t（以秒计）内下沉的距离x（以cm计）。以v表示。v=dx/dt,沉降作用,1、沉降概念：2、沉降速率：v=dx/dt3、沉降常数（沉降系数，S）单位引力场沉降分子下沉的速率。S=v/2x v：沉降速率（dx/dt）可以从实验测得。：离心机转子每秒钟的角速度，以弧度/秒计。（即2 转子每秒钟的转速）x：蛋白质界面中点与转子中心之间的距离（以cm计）。,Svedberg单位的定义：,单位引力场沉降分子下沉的速率。取 1 10-13秒为一个Svedberg单位。例：牛血清清蛋白的沉降常数为:4.410-13用Svedberg单位则为:4.4 S原核细胞核糖体的沉降常数为:7010-13用Svedberg单位则为:70 S,蛋白质的沉淀,1、概念：蛋白质分子发生凝聚，从溶液中析出的现象。2、蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体。稳定因素：水化膜 电荷 破坏稳定因素，就可使蛋白质颗粒凝聚而沉淀。,3、沉淀方法：,盐析法有机溶剂沉淀重金属盐沉淀条件:pHpI(Pr-M+)某些酸类沉淀条件：pHpI(Pr+X-)加热变性沉淀,盐析法,加高浓度中性盐使蛋白质沉淀析出。NaCl、（NH4）2SO4、NaSO4等。破坏蛋白质胶体周围的水化膜，中和了蛋白质分子的电荷，使蛋白质沉淀而析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。分离制备蛋白质的常用方法。,有机溶剂沉淀,有机溶剂：乙醇、丙酮等。破坏蛋白质颗粒表面的水化膜。pH=pI时，可加速蛋白质沉淀。低温（04）。,重金属盐沉淀,反应条件:pHpI,不溶性蛋白盐,氯化高汞、硝酸银、醋酸铅、三氯化铁等。,M+：重金属离子,某些酸类沉淀,反应条件:pHpI,不溶性蛋白盐,苦味酸、单宁酸、钨酸、鞣酸、三氯乙酸等。,X-：酸根,一些常见的蛋白质沉淀剂,、盐：破坏水膜，中和电荷盐溶、盐析的概念、有机溶剂：破坏水膜、重金属盐：、一些酸类物质：与蛋白质生成不溶性盐。如：苦味酸、单宁酸、,4、应用：,蛋白质的分离制备灭菌技术生物样品的分析、杂质除去等都要涉及此反应。,（三）蛋白质的变性,1、概念：蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构（次级键，特别是氢键）被破坏，从而改变其理化性质，并失去生物活性，这称为蛋白质的变性。,蛋白质的变性,（三）蛋白质的变性,2、变性因素：物理因素：加热、高压、振荡或搅拌、紫外线照射、超声波及射线等。化学因素：强酸、强碱、重金属离子和尿素、乙醇、丙醇等有机溶剂。3、变性实质：维系蛋白质空间结构的次级键断裂，其特定的空间结构被改变或破坏。二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。蛋白质变性的主要标志是生物功能的丧失。,介电常数,介电常数是两种电荷被真空隔绝时的电势与被介质隔绝时的电势的比值。表示介质影响相反电荷间吸力的数值。,4、变性蛋白质的特征：,理化性质的改变：溶解度降低；粘度上升；易被蛋白酶水解；不能结晶。生物学性质的改变 生物活性表失（酶失去其催化活性、激素失去其调节性、抗体失去其生物活性、细菌蛋白失去其致病性。）,一些与食品相关的蛋白质的热变性温度/,蛋白质的变性程度较轻时，去除变性因素后，蛋白质恢复原有空间构象和生物活性的现象称为复性。,复性(renaturation),、实际应用,消毒灭菌中毒的急救临床检验保存和制备生物制剂有利于蛋白食物的消化吸收,蛋白质的凝固,变性蛋白质分子互相凝聚或互相穿插缠绕（结）在一起的现象。蒸蛋,（四）蛋白质的水解,检查蛋白质水解程度的方法：,用Van Slyke 测自由氨基的方法，当水解完全时，自由氨基N趋于恒定。用检查双缩脲反应的消失（水解完全后就不再呈阳性反应）。,与亚硝酸的反应,（五）蛋白质的颜色反应,作为蛋白质的定性和定量试验。作为分析氨基酸的显色反应。作为检验蛋白质水解是否完全。,1、双缩脲反应,+NH3,双缩脲,尿素,1、双缩脲反应,+CuSO4,双缩脲,紫红色化合物,1、双缩脲反应,蛋白质或多肽,紫红色,氨基酸不出现此反应。当蛋白质溶液中蛋白质的水解不断加强时，氨基酸浓度上升，其双缩脲呈色的深度就逐渐下降，因此双缩脲反应可检测蛋白质水解程度。,2、与水合茚三酮的反应,2,+,沸腾,蓝紫色化合物,蛋白质溶液,3、蛋白质黄色反应,蛋白质溶液+浓HNO3,白色沉淀,加热,黄色沉淀,含Phe、Tyr、Try的蛋白质所特有的反应,4、米伦氏反应,米伦试剂：硝酸汞 亚硝酸汞 硝酸 亚硝酸的混合液 蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。,5、乙醛酸反应,在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间出现紫色环。色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应。,6、酚试剂（福林试剂）反应,蛋白质一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及钨钼酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的化合物）。定量测定蛋白质含量。,蛋白质的颜色反应,蛋白质的颜色反应,蛋白质的紫外吸收,波长：280nm引起紫外吸收的因素：主要是酪氨酸和色氨酸(Tyr,Trp)的共轭双键。可用于蛋白质的定量分析。,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收光谱,蛋白质的别构作用,含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个蛋白质分子构象、性质和功能发生改变的作用称蛋白质的别构作用。因别构而产生的效应称别构效应。正别构效应 负别构效应,酶的别构效应,别构酶,某些物质能与酶分子上的非催化部位特异地结合，使酶蛋白分子构象发生改变，从而改变酶的活性，这种现象称为酶的别构调节。具有这种调节作用的酶，称为别构酶。,第六节 蛋白质的提取、分离纯化和测定,1、生物材料的选择：2、细胞的破碎：3、提取：4、过滤：5、分离：6、提纯：7、测定：,细胞的破碎：,机械法：高速组织捣碎法玻璃匀浆器研磨（加砂）化学及生物化学法：自溶溶菌酶处理法表面活性剂处理法,物理法：反复冻融法冷热交替法超声波处理法加压破碎法十二烷基磺酸钠氯化十二烷基吡啶脱氧胆酸钠,细胞破碎,如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白释放出来。动物细胞可用匀浆器、组织捣碎机、超声波等方法破碎。植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理。微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难。有超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法。,蛋白质的分离纯化和鉴定,提取分离纯化鉴定,提取,提取通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。经过处理和破细胞的原材料中的有效成分，可用缓冲液，或稀酸、稀碱、有机溶剂（如丙酮、乙醇）等溶液提取。有时还可以用蒸馏水提取。,理想的提取溶剂应具备下述条件：,对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。,一般用缓冲液保持pH。可溶蛋白常用稀盐提取，如0.1Mol/L NaCl。脂蛋白可用有机溶剂提取，不溶蛋白用稀碱处理。提取的原则是少量多次。要注意防止植物细胞液泡中的代谢物改变pH，可加入碱中和。为防止酚类氧化可加5mMol/L维生素C。加入SH基的保护剂，防其被氧化。加碘乙酸可抑制蛋白酶活力，防止蛋白被水解。加入EDTA，防重金属对蛋白质的破坏。低温操作。,提取,搅拌,搅拌能促使欲提取物与提取液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。,粗提,主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。常用以下方法：沉淀法分级法：常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白 除盐和浓缩,分离,用适当方法使蛋白质从提取液中分离出来。,分离方法：等电点法盐析法有机溶剂沉淀法,核酸沉淀剂：MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素、核酸酶等。蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、SDS等，也可除多糖，沉淀后应迅速盐析除去沉淀剂，以免目的蛋白变性。选择变性：用加热、调节pH或变性剂选择性地变性杂蛋白。如提取胰蛋白酶或细胞色素C时，因其稳定性高，可用2.5三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀。,沉淀法,分级法,常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白,盐析后样品中含大量盐类，用透析除去。也可用分子筛，如Saphadex G25层析除盐。如样品过稀，可用冻干、超滤等方法浓缩。,除盐和浓缩,精制,如需高纯样品，应精制。常用方法有各种层析、电泳、等电聚焦、结晶等。蛋白结晶不等于无杂质，但变性蛋白不能结晶，所以可说明其具有生物活性。,纯化,从提取液中分离（沉淀）出来的蛋白质，仍含有各种各样的杂质（包括盐类、非蛋白质物质和其它蛋白质），需要进行纯化才能达到一定纯度。,纯化蛋白质的方法：透析法凝胶过滤法超滤法纤维素柱层析法亲和层析法电泳法超离心法,鉴定,鉴定蛋白质纯度的方法：层析法电泳法（聚丙烯酰胺凝胶电泳法）,参考书：,生物化学实验原理和方法李建武等编，北京大学出版社生化技术导论 中山大学生物系生化微生物教研室编，人民教育出版社生化实验方法和技术张龙翔、张庭芳等编，高等教育出版社现代生物学技术张丰德、王秀珍主编，南开大学出版社生物化学郑集 陈钧辉编著 高等教育出版社,实验:酸性磷酸脂酶的分离、纯化 操作步骤,（一）粗酶液制备 将生长5-7天的绿豆芽去子叶和根，取茎部，用蒸馏水冲洗数遍。置吸水纸上吸干表面水分。准确称取200克，剪成小段，置研钵（或组织捣碎机）内，加入少量蒸馏水及少许石英砂，在冰盘中研磨成匀浆。匀浆用双层纱布过滤，去残渣，滤液静置一小时，或置冰箱中过夜，以充分提取。然后在6000rpm下离心20-30分钟，弃去沉淀，取上清液，并用蒸馏水定溶至200毫升，置冰箱中备用。,实验:酸性磷酸脂酶的分离、纯化 操作步骤,（二）硫酸铵分级分离 取上述粗酶液100毫升，置于烧杯中，加固体（NH4）2SO4使达40%饱和度（0.242克/毫升）。加硫酸铵时，应边搅拌，边缓慢加入，以防止局部硫酸铵浓度过大而引起酶的变性。盐析半小时后，3000rpm离心20分钟，弃去沉淀，将上清液倒入量筒中，量准体积，然后倒入烧杯中，加固体硫酸铵至75%饱和度（0.24克/毫升），盐析半小时后，3000rpm离心20分钟，弃去上清液，沉淀用20毫升左右蒸馏水溶解，置处理好的透析袋中，悬浮在蒸馏水中在4下透析24小时（中间换水2-3次）直到用饱和氯化钡溶液检查透析袋外部溶液中硫酸根SO42-的含量，无沉淀产生为止，然后将酶液用蒸馏水稀释到100毫升，置冰箱中保存备。,【目标测试】,1.词解：肽键 多肽 Pr的等电点 Pr的变性作用2.填空：a.开链多肽和Pr分子具有_末端和_末端。b.Pr分子的二级结构主要是_和_结构。c.某Pr分子的等电点是6.5，置于PH8.9 的溶液中，该Pr带_电荷，电泳时向_极移动。,问题,A、肽键B、盐键C、二硫键D、氢键E、疏水键1、蛋白质分子中某些氨基酸的疏水侧链集中可形成2、蛋白质分子中两个半胱氨酸残基间可形成3、蛋白质分子中稳定-螺旋的键力是4、蛋白质完全水解时，分子中何种键断裂,问题,A、-螺旋B、-片层C、亚基D、氨基酸排列顺序E、氢键1、蛋白质主链构象之一是2、属于蛋白质一级结构的是3、属于蛋白质二级结构的是4、属于蛋白质三级结构的是,问题,A、破坏蛋白质分子表面的水膜，中和其电荷B、破坏蛋白质的空间构象C、两者均有D、两者均无1、蛋白质变性2、蛋白质变性沉淀,思考题,1、某蛋白质分子的等电点是5.0，置于PH8.6的溶液中，该蛋白质带何种电荷？电泳时向哪极移动？2、运用所学生化知识简述蛋白质结构与功能的关系。,血浆脂蛋白,、概念：血脂与载脂蛋白结合形成的微粒。、组成：载脂蛋白质、TG、PL、Ch、CE、分类：乳糜微粒 电泳分类法 前脂蛋白 脂蛋白 脂蛋白 乳糜微粒（CM）极低密度脂蛋白（VLDL）密度分类法 低密度脂蛋白（LDL）高密度脂蛋白（HDL）、组成特点及功能：,、组成特点及功能：,分类合成部位功能CM小肠粘膜细胞转运外源性TG和Ch到全身VLDL 肝细胞转运内源性TG到全身LDL 血浆转运内源性Ch从肝到全身HDL肝肠转运Ch从肝外组织到肝脏代谢,教学资源,教 材：食品生物化学天津轻工业学院、无锡轻工业学院合编，中国轻工业出版社参考书：生物化学简明教程聂剑初、吴国利等合编，高等教育出版社 生物化学 周爱儒等主编，人民卫生出版社 生物化学郑集 陈钧辉编著 高等教育出版社 食品生物化学杜克生编著，化学工业出版社医学细胞生物学导论余从年 胡继鹰主编，科学出版社,一、蛋白质的功能多样性,1.催化功能 2.结构功能 3.运输功能 4.贮存功能 5.运动功能,6.防御功能 7.调节功能 8.信息传递功能 9.遗传调控功能 10.其它排泄功能,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,Edman氨基酸顺序分析法,