生物化学实验-蛋白质性质试验.ppt

生物化学基础实验教学课件,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,生化与分子生物学实验室 于乐军,目录,实验一 生物化学实验技能培训 实验二 蛋白质部分性质实验 实验三 Folin-wu法定量测定血糖的含量 实验四 Folin-酚试剂法测定蛋白质浓度 实验五 氨基酸的纸层析 实验六 醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白 实验七 酵母RNA的提取及鉴定 实验八 DNA的提取及测定 实验九 胰蛋白酶的活力测定 实验十 水果中维生素C的定量测定 实验十一 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳牛血清,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,生物化学实验技能培训,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,通过生物化学实验应该做到：,学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,实验室规则,实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理。实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。配制试剂按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收；昂贵试剂需要回收，不得丢弃。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。强酸强碱以及其他实验废液必须倒入废液桶。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,实验室内严禁吸烟、饮水和进食，严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,蛋白质部分性质实验 蛋白质颜色反应和沉淀反应,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。,第一部分 蛋白质的颜色反应,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,一、试验原理,二、实验仪器1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。3、Millons试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。4、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml5、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml6、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.7、尿素晶体 8、浓硝酸 9、冰醋酸 10、浓硫酸,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（一）米伦（Millons）反应原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。操作：1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millons试剂0.5ml，于电炉上小心加热，溶液即出现玫瑰红色。2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millons试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，凝固的蛋白质出现红色。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,四、实验步骤,（二）双缩脲反应原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。操作：1、尿素实验取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热使其熔化成液体，此时有氨气放出，可用湿润的试纸检验，至液体重新结晶出现白色固体时，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。2、蛋白液实验取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（三）黄色反应原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。操作：取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（四）茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。操作：取蛋白液1ml于试管中，加4-8滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,第二部分 蛋白质的沉淀反应,一、试验原理蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。,蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,二、实验仪器1、移液管 2、吸管 3、试管 4、电炉三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。2、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。3、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。4、95%乙醇。5、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml6、硫酸铜溶液：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml7、氯化钠晶体8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml9、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。10、1%醋酸溶液。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,四、实验步骤（一）蛋白质的盐析作用原理：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。盐析作用一般不使蛋白质变性。操作：1、取试管1支，加蛋白液2ml，然后加固体硫酸铵(加的过程要缓慢，加的量要少随时摇匀），直至其饱和（大约为50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（二）有机溶剂沉淀蛋白质原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。操作：取一试管加蛋白液1ml，加入晶体氯化钠少许，待溶解后再加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。某些有机酸的酸根则与蛋白质的自由氨基结合而沉淀。操作：1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（四）生物碱试剂沉淀蛋白质原理：植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物成为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸等。当溶液PH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂的负离子发生反应而沉淀。操作：取2支试管，分别加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸和鞣酸数滴，观察现象。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（一）米伦（Millons）反应1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millons试剂0.5ml，电炉小心加热观察颜色变化。2、蛋白质实验：取2ml蛋白液，加Millons试剂0.5ml，出现白色的蛋白质沉淀，小心加热，观察现象。（二）双缩脲反应1、取少量尿素晶体放在干燥的试管中，微火加热熔化，至重新结晶时冷却。然后加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察现象。2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，摇匀，再加2-4滴1%CuSO4溶液，混匀，观察现象。（三）黄色反应 取一支试管，加入1ml蛋白液及浓硝酸5滴。加热，冷却后注意颜色变化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，颜色有什么变化？（四）茚三酮反应 取蛋白液1ml于试管中，加10滴茚三酮溶液，加热至沸，即有蓝紫色出现。,（一）蛋白质的盐析作用1、取试管1支，加蛋白液2ml，然后加固体硫酸铵(加的过程要缓慢，加的量要少，随时摇匀），直至其饱和（大约为50%）。摇匀静置数分钟，则有球蛋白析出。2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵，直至饱和为止，此时析出为清蛋白。再加入少量蒸馏水，观察沉淀是否溶解。（二）有机溶剂沉淀蛋白质试管中加蛋白液1ml，加晶体氯化钠少许，溶解后加95%乙醇3ml,摇匀，观察现象。（三）重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质1、取试管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸铅溶液，另一支管中滴加1%硫酸铜溶液，至有沉淀产生。2、取一支试管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混匀，观察结果。（四）生物碱试剂沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加饱和苦味酸数滴，观察现象。,蛋白质的颜色反应,蛋白质的沉淀,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,登录名：自己的学号密码：自己的学号大家先把电子版的实验报告作好，然后在周五或周六以后再上传文件实验报告要求：1目的2原理3实验仪器4实验试剂5实验步骤6实验结果7实验分析下次实验：血糖的定量测定-folin-wu法,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,Folin-Wu法定量测定血糖的含量,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,1.氧化供能 2.人体的主要组成成分之一 糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成脂肪和某些非必需氨基酸等3.糖代谢紊乱供能障碍一系列代谢变化,糖的重要生理功能：,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,血糖及血糖水平的概念：,血糖：指血液中的单糖：葡萄糖,血糖水平：血浆中葡萄糖浓度,血糖总维持在恒定水平：3.96.7mmol/L,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,血糖的来源和去路,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,血糖测定的目的和意义,临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。,调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。血糖水平异常：高血糖及糖尿病；低血糖,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,高血糖症：指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，临床上最常见的病理性高血糖症是糖尿病。糖尿病：是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病,系胰岛素绝对不足或相对不足，以高血糖症为基本生化特点。同时伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱，甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,症状随机血浆葡萄糖 11.1mmol/L,或空腹血浆葡萄糖 7.0mmol/L。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。糖尿病典型的症状是“三多一少”，即多饮、多尿、多食及消瘦,糖尿病的诊断标准,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,血糖的测定方法,测定方法,酶法：（1）己糖激酶法（HK）（2）葡萄糖氧化酶法（GOD法）特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化分析，为葡萄糖测定的参考方法，但是试剂较贵,无机化学法：Folin-Wu法，特异性差,有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法干扰因素多,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。学会制备无蛋白血滤液。掌握7200型可见分光光度计的使用方法。,一、目的要求,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,二、实验原理,葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）而沉淀。Cu2+(CuSO4)+葡萄糖 Cu+（Cu2O）无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应,Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物钼蓝。Cu2O+酸性钼酸试剂 蓝色钼化合物 OD420比色 血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,三、实验仪器,1、25mL血糖管3支；2、血糖管橡胶塞3个；3、沸水浴小锅1个；4、100mL锥形瓶2个；5、电炉1个；6、滤纸1盒；7、吸耳球2个；8、7200型分光光度计1台;,血糖管,7200型分光光度计,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。(2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。4、碱性硫酸铜溶液 A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4）。,四、实验试剂,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,5、酸性钼酸盐溶液：称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。,四、实验试剂,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,1、无蛋白血滤液的制备：用5ml移液管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。再加0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置515分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴）。用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。,五、实验步骤,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,2、血糖的定量测定：取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,按下式计算100ml全血中所含血糖的含量m=A1/A0C00.1100式中:m=100ml全血中含血糖毫克数;C0=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）；A1=样品液光吸收值;A0=标准液光吸收值 0.1：1ml无蛋白血溶液相对于0.1ml全血,六、结果计算：,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,七、思考题,实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？实验中，血糖管有什么作用？实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,注意事项：1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入10硫酸1-2滴，待暗棕色后再过滤。3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,五、实验步骤,1、无蛋白血滤液的制备：,蒸馏水7ml,摇匀,10%钨酸钠1ml,摇匀,0.33mol/L H2SO41ml,边加边摇,加毕充分摇匀,放置515分(沉淀变为暗棕色)(如不变色,再加0.33mol/L H2SO412滴),干滤纸过滤,无蛋白血滤液(每毫升相当于1/10ml全血),20ml锥形瓶,溶血(变为红色透明),用5ml移液管取全血1ml（已加抗凝剂,2、血糖的定量测定：,m=OD1/OD2 C 10 100,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,分光光度计的工作原理,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,朗伯-比尔定律,朗伯定律：A=k1L 比尔定律：A=k2C朗伯-比尔定律：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成正比。A=KLC,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,朗伯-比尔定律应用,A标=KC标LA样=KC样L,标准品法测定未知样品含量,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,7200型分光光度计的操作程序,连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。接通电源，使仪器预热20分钟。用键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式。用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。将0T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0T”键，此时显示器显示“000.0”,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,按 MODE键选择A模式将参比样品拉入光路中，按“0A/100T”键调0A/100T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样品的吸光度。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,分光光度计的使用注意事项:,比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。装样前处理：自来水反复冲洗蒸馏水漂洗2次待装溶液漂洗2次。用完后用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿盒中。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,拿放比色皿时，应持其“毛面”，不要接触“光面”。,若比色皿外表面有液体，应用擦镜纸朝同一方向拭干，以保证吸光度测量不受影响。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,比色皿内盛液应为其容量的2/3，过少会影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体金法染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,蛋白质不同方法比较,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,一、实验原理,蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,二、实验仪器1.卵清蛋白片 2.7200分光光度计3.试管 4.移液管三、实验试剂1.Folin-酚试剂A：碱性铜溶液 甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中 乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。临用时按甲：乙=50：1混合使用。2.Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。3.1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至 1000ml,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,四、实验步骤,1.标准曲线的绘制 取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2.样品测定 准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,【注意事项】,1、Tris缓冲液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、丙酮等均会干扰Folin-酚反应。2、当酚试剂加入后，应迅速摇匀（加管摇一管）以免出现浑浊。3、由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红外光区呈现较宽吸收峰区。不同实验室选用不同波长，有选用500或 540nm，有选用640nm，700或750nm。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选用波长640nm。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,【思考题】,蛋白质含量测定的方法有哪些，各有什么优缺点？,下次实验：氨基酸纸层析和维生素C定量测定-2，6，二氯酚靛酚法。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,附：标准曲线EXCEL表制作：,1、将浓度和所测OD值输入到EXCEL表中。2、将数据区域全部选中。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,3、点击“图表向导”键。,4、在图标类型中选择“XY散点图”，然后点击第一个图。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,5.点击“下一步”。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,6、在“图表选项”的“标题”中，于选中的红色区域内可以填入相应的名称。然后点击“完成”。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,7、鼠标点住数值点，右键单击，选择”添加趋势线”,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,8、在“添加趋势线”对话框中选择“线性”分析类型，然后点“确定”。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,9、点住直线右键单击，点“趋势线格式”，对标准曲线进行编辑。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,10、在“选项”中勾选“显示公式”和“显示R平方值”两项，点“确定”,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,11、曲线上会显示出此标准曲线的回归方程和R2，将样品测得的OD值（即Y值）代入方程，就得出样品的浓度（即X值）。这里的R2表示标准曲线的线性，即R2越接近于1，你所测的数值越准确，也越具有说服力。一般要求至少R2=0.99以上为好。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,氨基酸的纸层析,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,层析技术介绍,一、定义层析技术(chromatography）也称色谱技术，是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理以获得分离的方法。具体的说是根据被分离的混合物中各组分的理化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中进行分配以获得分离的方法。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,二、层析技术的原理,层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,三、发展简史,层析分离技术在20世纪初就已得到应用：1903年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体；1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析；20世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,四、层析技术的种类,按层析的机理划分：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。这两大类层析是以流动相不同来划分的。如同时区分流动相和固定相，划分为：气固层析、气液层析、液固层析和液液层析等。按操作形式划分：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,一、实验目的,1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层析的原理和操作技术；2、掌握分配层析法；3、掌握影响分配系数的因素。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,二、实验原理,纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,分配层析法：利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数。,溶质在固定相的浓度(Cs)分配系数=溶质在流动相的浓度（Cl),中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2 固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相;流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。由于混合液中各种氨基酸的值不同，所以移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,移动速率(比移值)：原点到层析点中心的距离 Rf=原点到溶剂前沿的距离,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,影响Rf值的主要因素：Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物质分配系数不同，Rf也就不同。（1）物质的结构和分子极性：物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之,Rf则较大。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（2）层析溶剂：首先，溶剂的纯度要高。其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0.050.85。再次，溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇-甲酸-水系统久放易引起酯化。（3）pH值：溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf改变；,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（4）滤纸：层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同，Rf也不同；另外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理（可用0.010.4M的HCl处理除去金属离子）.,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（5）室验室的温度和时间:温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用从而影响固定相的体积；也影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。层析必须在恒温条件下进行。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,（6）展开方式：上行法Rf小；下行法（层析缸上部有一盛展开剂的液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散）Rf大；环行法（最好用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf较小。（7）样品溶液中杂质：如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,二、实验仪器1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器,三、实验试剂 1、混合氨基酸（甘氨酸，苯丙氨酸）2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,四、试验步骤 1、取滤纸剪成2010厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端23cm处用铅笔画一横线，在线上画两个点（原点）。2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液和甘氨酸标准液，在上面两个点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点23次为佳。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端12cm处时，停止展层（大约.小时）。4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60）烘干。5、均匀喷上茚三酮无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生化与分子生物学实验室,五、实验结果与计算：1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种已知氨基酸和未知氨基酸的Rf值。,中国海洋大学生物基础实验教学中心生