生物化学-第14章基因工程.ppt

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering,第 十 四 章,目 录,主讲人李 宏,Transgenicblue rose,基因重组：,基因重组是细胞内经常发生的过程，是指整段DNA在细胞内或细胞间甚至不同物种之间进行转移或交换，并在新的位置上进行复制、转录及翻译的现象。基因重组又叫DNA重组，是自然界的常见现象。它在物种变异、进化、两性繁殖、基因表达和调控以及基因激活等方面都具有重要作用。,基因工程：,基因工程是指在试管内应用人工方法进行基因重组，把重组的基因导入细胞或细菌内，进行复制、转录和翻译。利用这一技术可以扩增DNA，生产蛋白质，或者创造生物新品种。该技术又称为重组DNA，DNA克隆或分子克隆。,第 一 节DNA的重组 DNA Recombination,一、概念：基因重组：不同来源的DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。重组类型：同源重组、特异位点重组、转座重组二、同源重组(homologous recombination）（一）概念：发生在同源序列间的重组，通过链的断裂和再连接,在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换,称为同源重组又称基本重组。是最基本的DNA重组方式.,（二）同源重组特点：不需要特异DNA序列，而是依赖两分子间序列的相同或相似性（同源性）；并且同源双链DNA分子必须紧密接触，相对应方能交换；重组时，两个DNA片段必须有一个发生断裂或有一段单链缺失。,（三）机制：Holliday模型；同源重组有4个关键步骤,两个同源染色体DNA排列整齐。一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应链连接，形成Holliday中间体。通过分支移动产生异源双链DNA。Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。,由于切开的方式不同，得到两种不同的产物：,片段重组体：（见模型图右边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体：（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,Holiday中间体,目 录,拼接重组体,片段重组体,E.coli同源重组分子机制：需数十种酶参与，其中最关键的是：RecA蛋白、RecBCD复合物及RuvC蛋白。,RecA蛋白是由rec基因编码的，可结合单链DNA，形成RecAssDNA复合物。RecA蛋白具有多个DNA结合位点，因此线性RecAssDNA复合物可以通过插入同源的DNA双螺旋的大沟，形成三链DNA中间物，并通过旋转逐渐取代双螺旋DNA中的一条链，与互补链配对，将同源链置换出来，产生新的双链DNA分子，从而完成DNA重组。,具有三种酶活性：依赖ATP的核酸外切酶；ATP增强的核酸内切酶；需要ATP的解旋酶活性。利用ATP水解提供能量，沿着DNA链运动，并以较快的速度将前方DNA解旋，当遇到CHI（因交换位点的DNA 结构类似于希腊字母 而得名）位点（5GCTGGTGG3）时，可在其下游切出3末端的游离单链。从而使DNA 重组成为可能。,RecBCD蛋白,有内切酶活性，可切开同源重组的中间体,RuvC蛋白,首先由RecB、RecC、RecD的复合物使DNA产生单链切口；RecA蛋白催化单链DNA对另一双链DNA的侵入，并与其中的一条链交叉，交叉分支移动，待相交的另一链在RecBCD内切酶催化下断裂后，由DNA连接酶连接缺失的远末端，形成Holliday中间体；此中间体再经内切酶RuvC切割、DNA连接酶连接完成重组。,E.Coli的同源重组过程:,(四).功能1.在减数分裂过程中，同源染色体之间进行交换，形成生物个（群）体的多样性。2.是DNA损伤修复的重要机制之一。,二、细菌的基因转移与重组,（一）接合作用,当细胞与细胞、或细胞与细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌），这种类型的DNA转移称为接合作用(conjugation)。并非所有质粒DNA都能转移，而是只有某些较大的质粒（如F因子）才能通过接合作用发生转移。因F因子含有细菌的性鞭毛蛋白编码基因。能表达形成细菌的表面性鞭毛。,细菌的基因转移与重组有四种方式：接合、转化、转导和细胞融合。,可接合质粒如 F 因子(F factor),质粒 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,F+,F-,性鞭毛连接,酶切单链,（二）转化作用,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。例如：当细菌破裂溶解（溶菌）时，其裂解的DNA片断可被另一细菌作为外源DNA摄取，并重组整合进自己的基因组，随细菌基因一起复制、转录、翻译，使受体菌获得新的遗传表型。,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,（三）转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来，再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。,自然界常见的转导作用是由噬菌体感染宿主菌（细胞）时，伴随发生DNA转移和基因重组。过程：噬菌体感染宿主菌后有两种生活方式：溶菌性生长途径和溶源性生长途径。,噬菌体DNA在宿主菌内进行自我复制，迅速增殖，并进行转录和翻译，组装成大量新的噬菌体。连续增殖直到把细菌涨破，新的噬菌体释放出来，又可再感染其他细菌。,1.溶菌性生长途径：,2.溶源菌生长途径：,是噬菌体DNA整合进宿主染色体，随宿主DNA复制而被动复制，这种整合了噬菌体DNA的细菌称为溶源菌。在溶源菌生长中，噬菌体与宿主菌可以共存维持无数代，直到宿主遭遇特殊事件时，使原噬菌体DNA从细菌染色体上被切下再进入溶菌途径。当原噬菌体DNA从细菌染色体被切下时，如果有部分宿主DNA被随着切下，这种带有宿主DNA的噬菌体称为转导噬菌体。转导噬菌体再次感染细菌时就可将前一宿主DNA转移至新的宿主细胞，发生转导作用。如图,噬菌体的生活史,溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径(lysogenic pathway),例,目 录,目 录,概念：在整合酶催化下，在两个DNA序列的特异位点之间发生的整合作用称为位点特异重组(site-specific recombination),种类：噬菌体DNA的整合;细菌的特异位点重组；免疫球蛋白基因的重排；转座重组等。,三、位点特异重组,在噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；,（一）噬菌体DNA的整合（了解）,2.特异位点：噬菌体重组的特异位点称attP(attachment site phage)，含P、O和P三个序列组成。大肠杆菌的重组位点attB（attachment site bacteria），含B、O和B三个序列。O是15bp的核心序列，是attB和attP所共同的.而其两侧的序列是B，B和P，P,被称为臂。整合酶与两个核心序列都相结合。,P O P B O B,（2）整合宿主因子（integration host factor IHF）由大肠杆菌产生，结合于attP，对整合起促进作用。（3）切除酶（excisionase Xis）由噬菌体xis基因编码。指导噬菌体DNA从宿主的染色体中切出来。4.过程：噬菌体编码整合酶。这个酶能指导噬菌体DNA通过重组位点attP插入E.coli的重组位点attB处发生交叉重组，将两个较小的环状DNA分子变成一个大环。,3.参与的整合的酶（1）整合酶（integrase Int）：由噬菌体int基因编码，指导噬菌体DNA插入到宿主的染色体中。,鼠伤寒沙门杆菌由鞭毛蛋白决定的H抗原有两种，分别为H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白。但有少数细菌呈相反H抗原，这种现象称为鞭毛相转变。这种抗原相位的改变是由一段995bp的DNAH片段,发生倒位所致。,（二）细菌的特异位点重组（了解）,1.H片段的组成和功能：两端各有一个14bp的反向重复序列（特异重组位点-hix）。中间是hin基因，编码特异的重组酶-倒位酶，催化H片段倒位重组。hin基因两端各有一个启动子（P），其中一个启动子启动hin基因表达产生倒位酶，另一个启动子正向启动邻近的H2和rH1基因表达，分别产生H2鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白。阻遏蛋白可抑制远方H1基因的表达。因而结果是H2表达而H1不表达。,以hix为特异重组位点，在倒位酶作用下，两个hix之间的H片段进行特异位点重组(倒位)。其结果是H2和rH1基因不表达，因为没有了启动子。但远方的H1基因因没有阻遏蛋白的抑制而得以表达。所以，倒位重组的后果是表达H1鞭毛蛋白而不表达H2鞭毛蛋白。因此，沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛蛋白质H1和H2的交迭表达。在某一时期，菌体表达其中的一种，但从不表达两种。,2.倒位重组及后果：,例：细菌的特异位点重组,沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变,1,2,2,1,（三）免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。轻链的基因族上分别有L、V、J、C四类基因片段。L-前导片段；V-可变片段；J-连接片段；C-恒定片段。重链的基因族上有L、V、D、J、C五类基因片段，D-多样性片段。,轻链的基因片段：,重链的基因片段：,重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence,RSS),回文七核苷酸序列,富含A九核苷酸序列,间隔,其九核苷酸序列提供最初的识别位点，七核苷酸序列为切割位点。催化此重排的重组酶基因rag(recombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。RAG1识别信号序列，然后 RAG2加入形成复合物，共同促进重排。抗体基因片段的连接过程如图。,V,J,分子内转酯反应,单链切开转移核苷酸修复、连接,免疫球蛋白基因重排过程,目 录,四、转座重组,有些基因可从基因组的一个位置转移到另一位置，这些可移动的DNA序列包括有插入序列和转座子。由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。,1.插入序列(insertion sequences,IS)组成：是一大约长7501500bp的DNA片断。其中包括：二个分离的反向重复(inverted repeats,IR)序列；两翼有特有的正向重复序列；一个转座酶（transposase)编码基因，能表达转座酶引起转座。,2.转座形式：保守性转座：是指插入序列从原位迁移到新位。复制性转座：是指插入序列复制后，其中一个复制品迁移到新位，另一个原位不动。,（一）插入序列转座,插入序列的复制性转座,目 录,1.转座子(transposons)概念：可从一个染色体位点转 移到另一位点的分散的重复序列。2.转座子组成：两个反向重复序列；转座酶编码基因，其产物引起转座。抗生素抗性基因等有用的基因。,（二）转座子转座,转座子插入新的靶位点的过程包括：在靶位点交错切割DNA，将转座子同靶位点的突出末端连接起来，以及补齐缺口、致使靶位点出现正向重复序列。,由转座子介导的转座,目 录,转座对生物体的影响(1)致死性转座：当各种IS,Tn等转座因子插入到某一基因中后，此基因的功能丧失，发生突变。严重的话可导致生物体死亡。（2）改变生物表型：（3）促进生物进化：,第 二 节 重组DNA技术,DNA Recombination Technique,重组DNA技术的发展史,年 的豌豆杂交试验1944年 的肺炎球菌转化实验1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年 英国罗斯林研究所成功的克隆了“多莉”羊。所有这些工作的基础都是重组DNA技术。重组DNA技术就是基因工程，是对基因进行设计和改造的分子工程，包括基因重组、基因克隆和克隆基因的表达。,一、重组DNA技术相关概念,1.克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,2.克隆化(cloning)获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。3.克隆技术水平：分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆。在分子水平上进行。细胞克隆。在细胞水平上进行。个体克隆（动物或植物）,（一）DNA克隆,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，再从中筛选出含有目的基因的转化子细胞，然后进行扩增、提取，获得大量同一DNA分子，即为DNA克隆。也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。,4.DNA克隆,基因工程的基本程序,基因工程的基本程序是：（1）获取目的基因（外源DNA片段）（2）将目的基因连接到载体上，得杂化载体；（3）将杂化载体（DNA重组体）引入宿主细胞（受体细胞），使目的基因及载体上其它基因得以转录和翻译。,载体质粒,外源DNA片段,外源DNA插入,剪切,引入宿主细胞,选出含有重组DNA的细胞并扩增,a,b,b,A,A,b,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。,基因工程目的：分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,（二）工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,在重组DNA操作过程中，首先必备的工具就是各种工具酶。例如：,重组DNA技术中常用的工具酶,Werner Arber瑞士,Hamilton O.Smith美国人,Daniel Nathans 美国人,发现限制性核酸内切酶及其在分子遗传学方面的应用,1978年共获诺贝尔奖。,限制性核酸内切酶,1.定义限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是能识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,3.作用：在细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。对细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义。,2.分类：限制性核酸内切酶已发现1800种之多。根据酶的组成，所需因子及裂解DNA方式不同，可分为三类：、型。（基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示该酶发现的先后次序。,4.酶的命名：,Hin d,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,通常用三个斜体字母的略语表示。,5.类酶识别DNA序列特点 回文结构,6.平头或钝性末端、粘性末端：平头或钝性末端：有些限制性核酸内切酶可在同一水平上切断DNA双链，即形成平头或钝性末端。,Hind,+,+,Bam H,粘性末端：有些酶在切割DNA双链时，在两条链切口错开数个核苷酸，从而形成突出的3粘性末端或5粘性末端。,作用模式图,产生3突出粘性末端,Pst I,作用模式图,产生平末端(blunt end),Alu I,不同的限制性内切酶识别DNA中的核苷酸序列长短不一，分别为4、6或8个核苷酸序列。如果DNA序列是随机的：特异4核苷酸序列约256bp出现一次；特异6核苷酸约4kp出现一次；特异8核苷酸约65kp出现一次。,同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，能产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)，配伍未端可进行相互连接。,Bam H,Bg l,+,+,2.DNA连接酶(DNA ligase)基因工程的缝纫针,催化两条双链DNA分子的互补粘性末端或平末端的5磷酸基团与3羟基形成磷酸酯键。,EcoR I,DNA连接酶,作用模式图,连接粘性末端,连接平末端,Alu I,DNA连接酶,（三）目的基因,1.定义：应用DNA重组技术有目的地分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或某一感兴趣的蛋白质的基因,这些感兴趣的DNA序列或基因就称为目的基因或目的DNA，又称外源基因。,2.类型：有二种：（1）cDNA(complementary DNA)是以mRNA或病毒RNA为模板，经反转录合成的与RNA互补的单链cDNA。以单链cDNA为模板经聚合反应可合成双链cDNA。（2）基因组DNA(genomic DNA)是代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。,（四）基因载体（除红字外为了解）,1.定义:为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector)为使插入的外源DNA序列可转录、翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,2.载体的选择标准,在宿主内有独立复制的能力;具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；拥有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点）；分子量小，以容纳较大的外源DNA。（5）具有适当的启动子、增强子等调控元件；（6）生物安全性好。,3.常用载体 质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA,1.质粒(plasmid),存在于细菌染色体以外的小型环状双链DNA分子,质粒的特点：,有限制性内切酶切口，便于插入外源性DNA。,能在宿主细胞内独立自主复制；,带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。例如，质粒含有抗药性基因，使细菌对青霉素、四环素或重金属产生抗性，有利于基因工程中筛选转化子细菌；,(2).有三种构型：超螺旋型（SC）、开环型(OC)及线型(LC),在一般实验条件下三种构型的DNA分子电泳时，一般SC最快，LC次之，OC最慢。,-+,OCLC SC,pBR322质粒是较早构建的质粒载体。是由天然质粒pSC101、CoLE1p和SF2124构建而成。,1、pBR322质粒,特点：,其分子量比较小，为4363bp；,含有一个复制起始点(Ori)及与复制调节有关的序列，故能自我复制；,含有抗氨苄青霉素(ampr)和抗四环素基因(tetr)，分别编码抗氨苄青霉素和抗四环素的酶，使细菌产生抗性。便于重组转化菌的筛选。在ampr和tetr上各有一些限制酶切位点，这些酶切位点提供了外源DNA插入质粒的缺口。当外源DNA插入这些位点时，ampr和tetr基因失活，使细菌失去抗生素抗性，可用于重组转化菌的筛选。,有多种单一酶切位点。可在酶切位点处插入外源DNA。,目 录,噬菌体DNA改造成的载体系统:gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组DNA克隆）,2.噬菌体(phage)一种侵袭细菌的病毒。常用作克隆载体的噬菌体DNA有噬菌体和M13噬菌体。,M13噬菌体DNA改造的载体系统:（含lacZ基因）M13mp系列和pUC系列。它们是在M13基因间隔区插入了大肠杆菌的一段调节基因及lacZ基因的N端146个aa残基编码基因，其产物是半乳糖苷酶的片段。,含有pBR322的复制起始点、抗氨苄青霉素基因和大肠杆菌乳糖操纵子lacZ的一段基因，能编码半乳糖苷酶的片段。突变型lac-E.coli因编码半乳糖苷酶肽段的基因缺陷，只能表达该酶的片断（酶的C端）。及片断单独存在均无半乳糖苷酶活性，必须是在宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，半乳糖苷酶才有活性。从而使特异性化合物变为蓝色化合物。此称为互补。,M13 噬菌体pUC：,当在lacZ基因内插入外源基因时，lacZ基因不能表达片段，转染lac-E.coli后，在含有底物X-gal的培养基生长时出现白色菌落。当在lacZ基因内无外源DNA插入时，lacZ基因能表达片段，lac-E.coli 能表达肽，基因互补形成有活性的半乳糖苷酶，因此在含有底物X-gal的培养基生长时，菌落呈蓝色。这种lacZ基因内-半乳糖苷酶基因的插入灭活（即肽段不再互补）是常用的筛选重组体的方法。称为互补筛选法，也称为蓝白筛选。,蓝白斑筛选,3.柯斯质粒载体(也叫粘性cosmid)是兼有质粒和噬菌体双重特点的大容量载体，能插入DNA片断3045kb左右。,酵母人工染色体载体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体载体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他载体：,二、重组DNA技术基本原理,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,目 录,（一）目的基因的获取,根据已知氨基酸顺序推导出基因的核苷酸序列，然后可用DNA合成仪人工合成目的基因。先合成小片段，再将小片段依次连接成一个完整基因链。人工合成方法一般适用于较短的多肽或寡肽激素基因的合成。如胰岛素原如图,1.化学合成法,条件：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨 基酸序列。,*化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,2.基因组DNA文库(genomic DNA library),鸟枪法程序大致为：从组织或细胞中分离提取染色体基因组总DNA，用一种限制性酶将DNA部分消化，切成许多基因片段，然后将所得消化产物分别与同一酶消化的载体DNA进行连接，并转入宿主菌内进行扩增，不同细菌中的重组DNA分子内含有不同的染色体DNA片断，全部生长菌所携带的各种染色体DNA片断就是整个基因组。,采用鸟枪法建立基因文库，从文库中筛选出目的基因。,存在于转化菌内克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为基因组DNA文库，也就是某一物种的全套基因。又叫G-文库。（Genome library）。需要时可用探针技术将所需目的基因“钓”出来。如图,基因组DNA文库,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,*从基因组DNA文库获取目的基因,目 录,目 录,3.cDNA文库(cDNA library),以全部mRNA为模板，在反转录酶的催化下，生成与mRNA互补的cDNA单链，再以cDNA单链为模板复制成双链cDNA片断，与适当载体连接后转入受体菌扩增，这些受体菌包含了细胞所表达的全部基因信息，称cDNA文库。需要时，用适当的方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。过程如图,目 录,4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),PCR是一种在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。PCR技术是根据不同的研究目的，既可选择以DNA为模板，也可选择以RNA为起始材料，经逆转录成cDNA，然后以DNA或 cDNA为模板高效快速地扩增出目的基因片段，再进行克隆操作。唯一的要求是，对目的基因片段两侧的核苷酸序列了解清楚，以便设计出合适的引物，在RNA引物引导下，由Taq DNA聚合酶催化，进行2n指数递增方式扩增，从而获得大量目的DNA片段。,一、基本工作原理,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、基本工作原理,载体是将外源DNA片段引入宿主细胞的运载工具或媒介。如果载体不合适，外源基因很难进入受体细胞或是进入受体细胞也不能复制和表达，所以载体的设计和应用非常重要。常用的载体是经过改造的细菌质粒、噬菌体和病毒等。,（二）克隆载体的选择和构建,克隆载体的选择和改进是一种技术性非常强的专门工作，目的不同，基因性质不同，载体的选择和构建方法也不同。,（三）外源基因与载体的连接,1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,用限制性内切酶将载体DNA和目的基因切割后，应用DNA连接酶把目的基因接到载体DNA中形成一个完整的重组环状分子，叫做DNA重组体。因为它是由两种不同来源的DNA组合而成，所以又称为嵌合。,(1)同一限制酶切位点连接：用同一种限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段得到完全相同的粘性末端。将这两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。如图,1.粘性末端连接：,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,目 录,由两种不同限制性内切酶切割的DNA片断，如果具有相同类型的粘性末端，也可进行粘性末端连接。包括：配伍末端连接和非配伍末端连接如图,(2)不同限制酶切位点连接：,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目 录,2.平端连接 由相同或不同限制性内切酶切割产生的平端，可用DNA连接酶直接连接；粘性末端用酶处理削平或补平后，也可进行平端连接。如图,3.同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在两个DNA片段末端加上互补的同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。如图,目 录,平端连接,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,53,35,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶+dATP,末端转移酶+dTTP,目 录,同聚尾连接,利用核酸化学合成技术，合成含有多种限制性内切酶识别序列的双链DNA短片段，这类DNA短片段叫接头。然后用DNA连接酶把接头连接到外源DNA的两端，再用同种限制性内切酶切割人工接头和载体DNA，产生相同的互补粘性末端，进而按粘性末端连接法将目的DNA片段与载体DNA连接起来，构成DNA重组体。简单说就是由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,4.人工接头(linker)连接,人工接头及其应用,目 录,首先选择适当的受体菌，然后用特殊方法处理受体菌，使其成为感受态细胞，再根据载体的性质不同采用不同的方法将重组体导入受体菌。随着受体菌生长、繁殖，重组DNA得以复制扩增，此即无性繁殖。,1.受体细胞或受体菌的选择：多为大肠杆菌K-12改造的安全菌。容易接纳重组分子，处于感受态；对载体的复制扩增无严格限制；不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；不对外源DNA进行修饰；应为限制性内切酶和重组酶缺陷型。,（四）重组DNA导入受体菌,细胞表面暴露出一些可接受外源DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。细胞膜通透性增加（用Ga2+处理，可使细胞膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。受体细胞的修饰酶活性应表现最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。受体细胞本身应处于非生长繁殖阶段（即受体细胞染色体相对稳定）。不存在载体的筛选标记基因，大肠杆菌C600，HB101，JN109等常作为受体细胞。,2.感受态细胞的形成及特点：感受态是指细胞处于最适于摄取和容忍外源DNA的生理状态。感受态细胞特点为：,3.导入方式:根据载体性质不同，导入方式有：转化、转染 和感染,转化方法：化学法：大肠杆菌是应用最广泛的受体细胞。取新鲜对数生长期的大肠杆菌，用氯化钙处理后成为感受态细胞。将重组DNA加入细胞中，置低温后，在42作短暂热休克，DNA重组体进入受体菌。然后加入培养基，经培养后在培养板上筛选出相应的转化子。电转化法：不需预先诱导细菌进入感受态，只依靠短暂的电击，促使DNA进入受体细胞。,将转化、转染或感染后的受体细胞进行培养可得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。但在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化，即使获得转化的细胞，也并非都含目的基因。因此转化后必须在不同层次，不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组体与非重组体，以及鉴定所需的特异性重组子。从而得到含有目的基因的阳性克隆株。筛选的方法很多，可分为直接选择法和间接选择法：,（五）重组体的筛选,(1)抗药性标记选择：如果克隆载体含有某种抗药性基因，如抗氨苄青霉素基因(ampr)或抗四环素基因(tetr)。转化后，将受体菌在含有这种抗生素的培养基中培养，非转化菌因不含抗生素基因而被杀死，生长菌即为转化菌，从而将转化菌与非转化菌区分开来。,1.直接选择法：是针对载体携带的某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。,是在重组DNA时将目的基因插入到载体的某一抗药基因中，使其灭活，失去抗药作用，这种重组DNA转化菌在此种抗生素培养基中不能生存而在其他抗生素培养基中能生存，从而被筛选。见图,插入灭活法筛选：,(插入失活法)抗药性标记选择,目 录,如果克隆基因能在宿主菌中表达，而且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用营养突变株进行筛选，此即标志补救。例如：将酵母DNA与噬菌体DNA重组后导入组氨酸缺陷型大肠杆菌，在无组氨酸培养基中培养，因酵母DNA含有咪唑甘油磷酸脱水酶基因，其表达产物与细菌组氨酸合成有关，所以生长菌即为转化菌。见图,标志补救法：,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,目 录,互补的检测,目 录,利用与目的基因序列互补的32P标记的探针（DNA或RNA）与转移到硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆DNA片断进行分子杂交，可直接选择并鉴定目的基因。常用的方法有原位杂交和Southern印迹技术。,分子杂交法：,原位杂交,目 录,Southern印迹,目 录,3.免疫化学筛选 如果克隆基因的表达产物-蛋白质是已知的，可用产物蛋白质的特异抗体与蛋白质抗原形成抗原-抗体复合物的方法进行筛选。常用的方法如免疫化学法及酶免检测分析等。,免疫化学法的基本原理是：将培养的转化子菌落经氯仿蒸汽裂解，释放抗原，将固定有特异抗体的聚乙烯薄膜盖在裂解菌落上，在薄膜上得到抗原-抗体复合物。再用125I-IgG与薄膜反应，125I-IgG可结合于抗原不同位点，最后经放射自显影检出阳性菌落。,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,目 录,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,重组DNA技术操作的主要步骤,目 录,表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志强启动子 翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射,2.真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,1.概念：同源重组、接合作用、转化作用、转导作用、特异位点重组、转座子、转座、限制性内切核酸酶、类酶识别序列、目的基因、基因载体。2.名词：转座(transposition)、基因组DNA文库（G-文库）、配伍末端(compatible end)。3.问题：目的基因获取的途径有哪些？目的基因与载体连接的方法有哪些？直接筛选重组体的方法有哪些？其中针对载体的筛选方法有哪些？针对目的基因的筛选方法有哪些？简述基因克隆的基本步骤。,本章主要掌握内容,