生化工程第三章微生物的代谢调节方式及人工控制.ppt
第三章 微生物的代谢调节方式及人工控制,第一节 代谢调节方式第二节 微生物代谢的人工控制,微生物的代谢,代谢是生物细胞内发生的各种生物化学反应的总称，也就是发生在微生物细胞内各种生物化学反应的总称。分解代谢（异化作用）合成代谢（同化作用）,回本章目录,相互关联，相互制约。细胞优先合成异化可维持更快生长的化合物 的酶。利用完后，再合成下一个酶。,回本章目录,回本章目录,微生物的代谢调节,微生物细胞有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调节（regulation of metabolism）系统，以确保上千种酶能准确无误、有条不紊和高度协调地进行极其复杂的新陈代谢反应。在发酵工业中，调节微生物生命活动的方法很多，包括生理水平、代谢途径水平和基因调控水平上的各种调节。,微生物代谢过程中的自我调节,微生物代谢调节系统的特点：精确、可塑性强，细胞水平的代谢调节能力超过高等生物。成因：细胞体积小，所处环境多变。举例：大肠杆菌细胞中存在2500种蛋白质，其中上千种是催化正常新陈代谢的酶。每个细菌细胞的体积只能容纳10万个蛋白质分子，所以每种酶平均分配不到100个分子。解决方式：组成酶（constitutive enzyme）经常以高浓度存在，其它酶都是诱导酶（inducible enzyme），在底物或其类似物存在时才合成，诱导酶的总量占细胞总蛋白含量的10%。,微生物代谢调节的概念与内涵,微生物代谢调节是指对微生物自身各种代谢途径方向的控制和代谢反应速度的调节。代谢反应方向的控制是控制代谢走何种途径，即解决代谢何种产物的问题。代谢反应速度的调节是控制代谢反应快慢，即解决代谢多少产物的问题。,回本章目录,第一节 代谢调节方式,代谢途径区域化代谢流向的调控代谢速度的调控细胞透性的调节,酶量（粗调）酶活（细调）,酶合成的诱导酶合成的阻遏,酶活性的激活酶活性的抑制,1、代谢途径区域化,原核微生物细胞虽然没有复杂的具有膜结构的细胞器，但也划分出不同的区域，对于某一代谢途径有关的酶系集中在某一区域，以保证这一代谢途径酶促反应的顺利进行，避免了其他途径的干扰；,通过酶的定位控制酶与底物的接触,与呼吸产能代谢有关的酶位于膜上；蛋白质合成酶和移位酶位于核糖体上；同核苷酸吸收有关的酶在G-菌的周质区。,1、代谢途径区域化,真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布，使其代谢活动只能在特定的部位上进行，如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上，DNA合成的某些酶位于细胞核里。,通过酶的定位控制酶与底物的接触,2、代谢流向的调控,微生物在不同条件下可以通过控制各代谢途径中某个酶促反应的速率来控制代谢物的流向，从而保持机体代谢的平衡。,由一个关键酶控制的可逆反应 同一个酶可以通过不同的辅基（或辅酶）控制代谢物的流向；,谷氨酸脱氢酶+NADP+催化谷氨酸的合成,谷氨酸脱氢酶+NAD+催化谷氨酸的分解,由两种酶控制的逆单向反应 在生物体代谢的关键部位的某些反应，是由两种不同的酶来催化的。即在一个“可逆”反应中，其中一个酶催化正反应，另一种酶则催化逆反应。如：葡萄糖+ATP 6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖+H2O 葡萄糖+Pi,己糖激酶,6-磷酸葡萄糖酯酶,微生物体内利用两种完全不同的酶，能十分精确地控制正反应和逆反应。,依据微生物生长繁殖的需要可以将各种酶划分为两类，即组成酶和诱导酶。组成酶也称为结构酶（固有酶），是微生物细胞固有的酶类，其生成受菌体固有酶的合成机构所控制,不依赖底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：EMP途径的一些酶。诱导酶则指酶的生成需要某些物质的诱导,依赖于底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：乳糖酶。,回本章目录,3、代谢速度的调控,（1）酶合成的调节（粗调）,通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，是基因水平上的调节，属于粗放的调节，间接而缓慢。诱导(induction)：是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。微生物通过诱导作用而产生的酶称为诱导酶（为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的酶类）。举例：E.coli在含乳糖的培养基中合成-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶等。,3、代谢速度的调控,（1）酶合成的调节（粗调）,酶合成的诱导（induction of enzyme synthesis）,诱导物(inducer)：底物或结构类似物，如：异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG，isopropylthiogalactoside）。,3、代谢速度的调控,（1）酶合成的调节（粗调）,协同诱导：一种诱导剂可以同时诱导产生若干种酶的现象，主要存在于短的代谢途径中。顺序诱导：一种诱导剂诱导产生的酶的反应产物可继续诱导产生下一个酶，这种连续诱导产生一系列酶的现象称为顺序诱导。先合成能分解底物的酶，再合成分解各中间代谢物的酶达到对复杂代谢途径的分段调节。,诱导作用的类型：,阻遏：它是阻碍代谢过程中包括关键酶在内的一系列酶的合成的现象，从而更彻底地控制和减少末端产物的合成。阻遏作用的类型：末端产物阻遏（end-product repression）：由于终产物的过量积累而导致生物合成途径中酶合成的阻遏的现象，常常发生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等这些重要结构元件生物合成的时候。例如过量的精氨酸阻遏了参与合成精氨酸的许多酶的合成。,酶合成的阻遏（repression of enzyme synthesis）,3、代谢速度的调控,（1）酶合成的调节（粗调）,分解代谢物阻遏（catabolite repression）：当微生物在含有两种能够分解底物的培养基中生长时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶的合成的现象。最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的培养基时,故又称葡萄糖效应。直接作用者是优先利用的碳源的中间代谢物实质是：因代谢反应链中某些中间代谢物或末端代谢物的过量积累而阻遏代谢中一些酶的合成的现象。,3、代谢速度的调控,（1）酶合成的调节（粗调）,操纵子（operon）：是基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操作基因和启动基因。结构基因(structural genes)：是决定某一多肽的DNA 模板，可根据其上的碱基顺序转录出相应的mRNA，然后再可通过核糖体转译出相应的酶;（编码蛋白质的DNA序列）启动基因(promoter)：能被依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的碱基顺序，是RNA聚合酶的结合部位和转录起点；（在许多情况下还包括促进这一过程的调节蛋白结合位点。）,3、代谢速度的调控,（1）酶合成的调节（粗调）,酶合成调节的遗传机制：操纵子学说,操纵基因（operator）：位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，是阻遏蛋白的结合位点，能通过与阻遏物相结合来决定结构基因的转录是否能进行；调节基因（regulator gene）：用于编码组成型调节蛋白的基因，一般远离操纵子,但在原核生物中,可以位于操纵子旁边,编码调节蛋白。,3、代谢速度的调控,（1）酶合成的调节（粗调）,（1）酶合成的调节（粗调）,诱导型操纵子：效应物存在导致基因表达。阻遏型操纵子：效应物存在导致基因表达的关闭。,3、代谢速度的调控,1、酶的诱导机制：(以E.coli乳糖操纵子为例),Structure of a typical operon,E.coli乳糖操纵子由lac启动基因(lacP)、lac操纵基因(lacO)和三个结构基因(lacZ、Y、A)所组成，三个结构基因分别编码-半乳糖苷酶、透过酶和转乙酰酶。乳糖操纵子是负调节的代表，在缺乏乳糖等诱导物时，由调节基因(lacI)编码的调节蛋白（即lac阻遏物）一直结合在操纵基因上，抑制着结构基因转录的进行。当有诱导物如乳糖存在时，乳糖与lac阻遏物相结合，使后者发生构象变化，结果降低了lac阻遏物与操纵基因间的亲和力，使它不能继续结合在操纵子上，操纵子的“开关”被打开，结构基因的转录、翻译可顺利进行。当诱导物耗尽后，lac阻遏物可再次与操纵基因结合，这时转录的“开关”又被关闭，酶就无法合成，同时，细胞内已转录好的mRNA也迅速地被限制性内切酶所水解，所以细胞内酶的合成速度急剧下降。,乳糖操纵子的诱导机制,色氨酸操纵子的阻遏是对合成代谢酶类进行正调节的典例。E.coli色氨酸操纵子也由启动基因、操纵基因和结构基因（5个）三部分组成。5个结构基因分别编码色氨酸合成途径中的5种酶。调节基因(trpR)远离操纵基因，编码阻遏物蛋白；其为由4个亚基组成的四聚体；单独的四聚体不能和操纵基因(trpO)结合，只有先结合了色氨酸分子后改变了四聚体的分子构象才能与trpO结合。当细胞内色氨酸浓度高时，色氨酸与阻遏物蛋白结合，形成完全阻遏物，与操纵基因结合，阻止结构基因转录（色氨酸为辅阻遏物）。当细胞内色氨酸缺乏或不足时，则导致阻遏物脱离操纵基因，使操纵基因“开关”打开，结构基因的转录又可正常进行。,2、终产物(反馈)阻遏机制:(以色氨酸操纵子为例),The Tryptophan Operon,3、分解代谢阻遏机制:,(以葡萄糖分解代谢物对乳糖分解酶的阻遏为例),E.coli 含有一个代谢产物活化蛋白CAP(catabolite activated protein)，也称cAMP受体蛋白CRP；CAP 和cAMP都是lac mRNA合成所必需的。CAP能与cAMP形成复合物，cAMP-CAP复合物结合在lac 操纵子的启动基因上，可促进转录的进行，实现正调节。葡萄糖分解代谢的中间代谢物能抑制腺苷酰环化酶活性并活化磷酸二酯酶，从而降低cAMP浓度，此时CAP不能被活化形成cAMP-CAP复合物，从而抑制了lac的转录。,有葡萄糖时：cAMP的产生受葡萄糖抑制。葡萄糖降解物抑制腺苷酸环化酶的活性，cAMP浓度下降，cAMP不与CAP结合，RNA多聚酶不能结合，转录不能进行。无葡萄糖时：cAMP浓度上升，cAMP与CAP(降解物的激活蛋白)结合,与启动基因结合，转录进行.,含有两种蛋白：传感器（或发射器）跨膜蛋白调节器（或接受器）可溶性蛋白传感器起蛋白激酶作用，能催化需ATP的自动磷酸化作用和将磷酸基转移给其他蛋白（如调节蛋白）的作用。若受外界或内部刺激（如渗透压、化学吸引剂、特殊分子的存在或缺乏），传感器分子便自动磷酸化，从而把刺激转换成生化信号（传感器分子的磷酸化状态）。此信号可通过磷酸基的转移将信号传给可溶性调节蛋白。磷酸化调节器可作为转录的激活剂或阻遏物，再与DNA序列相互作用。此二元系统是微生物中的信号传导模型，参与硫酸盐和氮代谢的调节。,4、二元调节系统,回本章目录,一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率，这种调节能够最大限度的使微生物细胞对周围环境变化作出快速反应。酶活调节的影响因素包括：底物和产物的性质和浓度、压力、pH、离子强度、辅助因子以及其他酶的存在等等。特点是反应快速。,（2）酶活性的调节（细调）,3、代谢速度的调控,（2）酶活性的调节（细调）,酶活性的激活（activation）前体激活：代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代谢中间产物的反馈激活：代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用。,3、代谢速度的调控,（2）酶活性的调节（细调）,酶活性的抑制（inhibition）：大多是反馈抑制,A.无分支代谢途径的调节：通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活性有抑制作用。,A B C D X Ea Eb Ec,抑制,B.有分支代谢途径的调节：在有两种或两种以上的末端产物的分支代谢途径中，调节方式较为复杂。分述如下：,（2）酶活性的调节（细调）,酶的顺序反馈抑制,A B C Ea,D E Y,F G Z,Eb,Ec,抑制,抑制,抑制,两个末端产物，不能直接抑制途径中的第一个酶Ea，而是分别抑制分支点后的Eb和Ec，造成中间产物C的积累，高浓度的C再反馈抑制Ea。,同工酶的反馈抑制,途径中的第一个反应（A B）被两个不同的酶所催化，一个酶被Y抑制，另一个酶被Z抑制。只有当Y和Z同时过量才能完全阻止A转变为B。另两个控制点（C D），（C F），分别受Y或Z的抑制。,同工酶是能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。,A B C E2,D E Y,F G Z,E1,E3,E4,抑制,抑制,抑制,抑制,协同反馈抑制,末端产物Y和Z单独过量，对途径中第一个酶E1无抑制作用，只有Y和Z同时过量，才能对E1具有抑制作用。另两个控制点的酶E2和E3分别被Y和Z所抑制。,A B C E1,D E Y,F G Z,E3,E2,抑制,抑制,抑制,累积反馈抑制,末端产物Y和Z单独过量时，各自对途径中第一个酶E1仅产生较小的抑制作用，一种末端产物过量并不影响其他末端产物的形成。只有当Y和Z同时过量，才能对E1产生较大的抑制作用。,A B C E1,D E Y,F G Z,40%,30%,58%,超相加反馈抑制,末端产物Y和Z单独过量时，各自对途径中第一个酶E1仅产生较小的抑制作用，一种末端产物过量并不影响其他末端产物的形成。当Y和Z同时过量，对E1产生的抑制作用则超过各种末端产物单独过量时的抑制的总和。,A B C E1,D E Y,F G Z,15%,20%,90%,酶活性调节的分子机制,主要有两种理论解释：别构调节理论（酶分子构象的改变）酶分子的化学修饰理论（酶分子结构的改变）,别构酶除了具有与底物结合的催化中心外，还具有与调节剂结合的调节中心。当酶与调节剂结合后，酶蛋白的构象发生变化，引起催化中心改变，从而引起酶活性的变化。,酶的共价修饰是酶蛋白在修饰酶催化下，可与某些物质发生共价键的结合或解离，从而导致调节酶的活化或抑制，以控制代谢的速度和方向。如糖原合成酶的磷酸化（高活性）和去磷酸化（低活性）。,酶活力调节的机制,变构酶理论：变构酶为一种变构蛋白，酶分子空间构象的变化 影响酶活。其上具有两个以上立体专一性不同的接受部位，一个是活性中心，另一个是调节中心。,活性位点:与底物结合变构位点:,与抑制剂结合,构象变化,不能与底物结合 与激活剂结合,构象变化,促进与底物结合,两种调节的对比,回本章目录,4、细胞透性的调节,细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。,第二节 微生物代谢的人工控制,微生物在正常情况下，通过细胞内的自我调节，维持各个代谢途径的相互协调，使其代谢产物既不缺少又不会过多的积累。而人类利用微生物进行发酵则需要微生物积累较多的代谢产物，因此对微生物的代谢必须进行人工控制。积累代谢产物的有效措施是：（1）反馈抑制作用的解除：实质是使代谢途径中的关键酶（别构酶）的调节亚基的结构基因发生突变，使末端产物或其类似物不再与别构中心结合，从而解除反馈抑制，积累末端产物；,（2）反馈阻遏作用的解除：实质是使调节基因或操纵基因发生突变，使调节蛋白改变或不发生，调节蛋白不再与末端产物相结合，或结合后的复合物不能同操纵基因结合，从而解除了末端产物对酶合成的阻遏；（3）遗传障碍：使某酶蛋白结构基因突变，使酶蛋白缺失或酶蛋白的活性中心改变，可以解除末端产物对途径中的第一个酶的反馈抑制，积累中间产物；（4）使细胞膜透性增大：如利用甘油缺陷型或生物素缺陷型或油酸缺陷型，通过控制甘油或生物素或油酸浓度以控制细胞膜的透性，使胞内代谢产物外漏，缓解反馈抑制或阻遏作用。,总体来说，人工控制微生物代谢的手段主要有两种：,一、生物合成途径的遗传控制,生物合成途径的遗传控制是通过诱变来实现的。这种突变不仅包括结构基因的突变，而且包括调节基因的突变。,1、代谢缺陷型菌株2、应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节3、产物降解酶缺失突变株4、细胞膜组分的缺失突变,1、代谢缺陷型菌株,在分支代谢途径中，可利用营养缺陷型来合成某种末端产物。,人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸,高丝氨酸脱氢酶,不能合成,可以大量积累,人工诱变的菌种不能产生,回本章目录,例人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸黄色短杆菌的代谢过程,抑制,回本章目录,在以积累末端产物为目的的发酵生产中，如果代谢途径单一无分枝，往往不能选用营养缺陷型突变株。要提高产量，最好采用抗反馈突变株。抗反馈突变株由于基因突变，它们的酶或无活性的原阻遏物不再与末端产物结合，从而不再发生酶的变构及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再与发生了突变的操纵基因结合，因此反馈调节被打破，即使在末端产物过量的情况下，也同样可以积累高浓度的末端产物。抗反馈突变株通常可以用添加末端产物类似物的方法来筛选。,2、应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节,末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反馈，但是它们不能参与生物合成。在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈控制的酶的结构，或是酶的合成系统已经发生了改变，它们不再受抑制或阻遏的影响，在类似物充斥的情况下照常能合成该种末端产物。例如，用类似物D-精氨酸选出的谷氨酸棒杆菌的抗反馈突变株可使L-精氨酸的产量得到提高。,2、应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节,Asp Asp-P Asa,Met,Hse,Thr,Lys,AK1,AK2,AK3,HSDH,例：黄色短杆菌抗-氨基-羟基戊酸（AHV）菌株能积累苏氨酸,AK1和HSDH的调节亚基的结构基因突变，不能与苏氨酸的结构类似物（AHV）结合，当然也不会同苏氨酸结合，所以能解除苏氨酸对AK1和HSDH的反馈抑制，因而积累苏氨酸。,Asp：天门冬氨酸；Asp-P：天门冬氨酰磷酸；Asa：天门冬氨酸半醛；Hse：高丝氨酸；Thr：苏氨酸；Met：甲硫氨酸；Lys：赖氨酸；AK：天门冬氨酸激酶；HSDH：高丝氨酸脱氢酶,3、产物降解酶缺失突变株,有的代谢产物由于相应降解酶的存在而在发酵液中不能稳定存在，因此可通过诱变获得缺乏降解产物的酶的菌株使发酵单位提高。,将诱变处理后的菌种接种到完全培养基上，生成的菌落再以影印法分别接种到含葡萄糖培养基和以产物作为唯一碳源的培养基上。在后一种培养基上不能生长的菌落就是缺乏产物降解酶的变异株。,4、细胞膜组分的缺失突变,以前经常提到反馈抑制和反馈阻遏，都是由于末端产物的浓度过高引起的。利用细胞膜组分的缺失突变使细胞膜的透性增大，可使代谢产物易于分泌到胞外，从而达到解除末端产物抑制或阻遏的目的。,例1：谷氨酸棒杆菌（生物素缺陷型）生产谷氨酸,PEP Pyr AcCoA,OAA akg Glu,Mal,PC,PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr：丙酮酸；AcCoA：乙酰辅酶A；OAA：草酰乙酸；kg：-酮戊二酸；Glu：谷氨酸；Mal：苹果酸；PC：丙酮酸羧化酶,生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，生物素在低于亚适浓度之前，增加生物素有利于丙酮酸的羧化产生草酰乙酸，进而有利于谷氨酸的合成；生物素是催化脂肪酸生物合成的初始酶乙酰辅酶A羧化酶的辅酶，该酶催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A，再经一系列转化合成脂肪酸，而脂肪酸又是构成细胞膜磷脂的主要成分，因此生物素可间接地影响细胞膜的透性。,生物素对谷氨酸合成的影响,例2：溶烷棒杆菌GL-21（甘油缺陷型）生产谷氨酸,磷酸二羟丙酮-磷酸甘油 磷酯,PGDH,该菌株的-磷酸甘油脱氢酶（PGDH）缺失，因此不能正常合成-磷酸甘油和磷酯。影响了细胞膜结构的合成而使得细胞膜透性增大，有利于谷氨酸在菌体外积累。,二、微生物发酵条件的控制,当菌株确定后，环境条件合适与否是发酵成败的重要因素，环境条件既影响微生物的生长，又影响代谢的速度和方向及产物的形成和积累。主要的有温度、pH、氧气含量、离子浓度等多种因素。,详细内容将在第七章发酵工艺过程控制中介绍,思考题,微生物自我调节部位,微生物代谢调节,名词解释,诱导酶 组成酶,协同诱导,顺序诱导,末端产物阻遏,分解代谢物阻遏,代谢速度的调控包括？,能根据图示辨别酶活性调节的类型。,酶活性调节机制,酶合成调节的机制（每个操纵子属于哪一类）,生物合成途径的遗传控制的方法原理,填空,简答,
